多光谱荧光成像内窥镜的超微型光学设计
抽象开发了微型宽视野多光谱内窥镜成像系统，可在宽波长范围内进行反射和荧光成像。内窥镜的直径为0.8mm，可用于小内腔（例如输卵管）的自然孔成像。从250到642 nm的五个激光器耦合到一个125 μm直径的多模光纤，并传输到内窥镜远端以进行照明。紫外线和蓝色波长激发内源性荧光团，可以为健康和疾病提供不同的荧光发射图像。可见波长提供了可合并用于伪白光成像和导航的反射图像。成像由300 μm直径三元透镜系统连接到3000元光纤。透镜系统设计用于70度全视角，工作距离从3mm到无限远，并且在纤维束的奈奎斯特截止时对比度为40％。测得的性能特征接近设计目标。利用内窥镜获得体模和猪生殖道的示例单色，伪白光和复合荧光图像。这项工作表明将高性能多光谱荧光成像系统包装到微型内窥镜系统中的可行性，该系统可能在癌症的早期检测中具有应用。
1.简介某些疾病的早期检测和诊断受到在深埋器官中获得高分辨率图像的能力的限制。例如卵巢癌，这是致命的女性生殖恶性肿瘤。卵巢癌通常表现出非特异性症状，目前的筛查方法（体格检查，经阴道超声，ca-125血液检查）在大型临床试验中用于一般人群的年度筛查已被证明不可靠或无效。由于缺乏明显的症状以及该疾病致命的表型（高级别浆液性卵巢癌（hgsoc））的特殊自然史，在及早发现阶段以使结果产生显着差异是有问题的。模型表明，hgsoc存在于一个隐匿无症状形式为3至4年，其中它太小，通过分泌的生物标记物，磁共振成像，计算机断层扫描来检测，并且可能超声波，随后迅速生长阶段在第4至5年出现症状时，此时肿瘤已经转移并致死。
新兴的共识表明，hgsoc的很大一部分（可能超过50％）实际上起源于输卵管，随后迁移到卵巢和腹膜。如果这个假设是正确的，那么它将通过使用相对便宜但坚固的光学组件通过微创内窥镜对疾病进行早期检测打开一个窗口。光学成像可以对疾病进行定位，并可以在需要侵入性*之前从可疑的血液标记物中确认诊断。高分辨率光学技术可能具有在早期检测所需的分辨率水平上产生结构和功能信息的能力，但自由空间光学器件无法透皮穿透人体并进入足够的深度。光纤和自由空间组件的小型化允许集成到微创内窥镜中。
人体通过阴道，子宫颈和子宫提供一条自然途径，以进入输卵管和卵巢。输卵管的近端输卵管开口位于子宫内，口直径为约1 mm。然后，管子扩张到大管内直径为约1 厘米在整个12至15厘米的曲折路径中，菌丝将管子连接到子房。以前，简单的白光成像内窥镜（称为输卵管镜）的外径（od）小于一mm，以前已经在体内对输卵管成像，以阻止生育。这些输卵管镜是通过*的工作通道引入的。通过连接到相干光纤束（cfb）的镜头进行成像。设计用于输卵管阻塞性*的输卵管镜缺乏足够的成像性能，无法筛查早期卵巢癌所表现出的细微变化。
筛检型输卵管镜的导航部分应采用宽视野（fov）进行前视，并且应采用大800 μm od。前视广角内窥镜具有三种主要技术，可将图像从远端传输到计算机：光纤束，微型检测器和光学扫描。现在，许多现代内窥镜直接在内窥镜中使用微型cmos检测器。微型探测器0.5 mm× 0.5 mm尺寸已被证明和1 mm× 1 mm检测器是可商购的。随着技术的不断萎缩，它可能是可行的。800 μm od内窥镜，但当前不是一个选择。诸如压电扫描光纤（sf）内窥镜之类的扫描技术也在继续缩小。1.2 mm的实现方式已用于对1 cm的远端输卵管进行体内成像。该技术具有明显的光学优势和有效的像素密度，但需要进一步的小型化才能进一步插入输卵管。的前视内窥镜成像技术使用cfb。内窥镜中的透镜将图像成像到cfb的远端表面上，然后在体外分离成像系统将cfb的近端图像成像到检测器上。对于亚mm直径的内窥镜，cfb方法仍然是可行的技术，但是与任何摄像头系统一样，在fov和分辨率之间需要权衡。输卵镜的有限尺寸限制了cfb像素的数量，从而损害了以接近细胞分辨率同时执行广域导航的能力。然而，
荧光成像可用于可视化组织化学成分的变化，非常适合于宽视场成像。特别是内源性荧光团（*，胶原蛋白，*腺嘌呤二核苷酸+氢等）在正常和异常组织中的浓度可能不同。使用紫外线和短波可见光激发源，可以在组织中激发不同的荧光团。正常，良性和癌性卵巢组织之间的内源性荧光差异已由研究人员和其他人使用光纤探针在体内和离体进行了表征和广域自发荧光成像。多光谱荧光成像（mfi）可以在反射率和荧光模式下成像，以测量光吸收或荧光发射，这两者都可以指示分子变化（血红蛋白或荧光团浓度的变化）或组合多个反射率图像用于伪白光成像。
先前已经证明了双模态光学相干断层扫描（oct）和荧光成像内窥镜。阿2.1-mm直径的sf内窥镜外源荧光团的多光谱荧光成像已经证实没有uv激发或oct能力。初步研究在使用1.2mmsf内窥镜对输卵管进行体内白光成像方面取得的成功有限。较大直径的装置难以穿过管子。直径为几百微米的侧视式探针也已被证明仅使用oct并使用双包层光纤进行oct和单点荧光检测。直径为几mm的其他内窥镜将荧光成像和oct的各种实现方式结合在一起。这些示例均未将宽视野荧光成像和oct组合到亚mm直径的包装中。此外，这些示例均未包含将mfi用于广域自发荧光检测的uv激发。
使内窥镜使用的宽视野mfi小型化是验证该技术在体内使用的下一步。在本文中，我们描述了小型mfi系统的光学设计和表征，以及将其集成到微型系统中的过程。800 μm直径输液镜原型。
2.设计与方法2.1.光学设计mfi光学设计由四个具有独立且相互关联的规格的光学子系统组成（图1）。遵循光的路径，四个光学子系统分别是：近端照明，远端照明，远端成像和近端成像。为了有效导航，全视场（ffov）的总体系统规格为70度。根据以前的研究，包括的照明波长为250、375、406、515和642 nm。激光源用于内窥镜原型，其中心波长与我们先前对离体卵巢和输卵管组织的mfi成像研究中的过滤氙弧灯提供的中心波长相似。紫外线和蓝色波长可有效激发内源性荧光团。在反射模式下以375、406和515 nm采样血液吸收曲线也可以提供诊断工具。后，通过获取并组合具有406、515和642 nm照明波长的图像序列，可以获得伪白光成像。包括250 nm光在内的宽光谱范围以及执行反射率和荧光成像的要求都需要单独的激发和照明通道。成像通道针对375至642 nm的成像进行了优化。因此，250-nm照明仅用于荧光模式，但是所有其他照明波长都可以用于反射率或荧光模式。为了适应大外径为的柔性内窥镜的集成800 μm，照明和成像通道限制为125 - 300 μm直径。套圈，拉线和保护套所需的剩余空间。具有类似机械设计但不具有mfi功能的内窥镜的机械和操纵细节已在之前发布。但是，设计确实允许125 μm直径的管腔，用于将来的其他功能，而又不超过总外径的要求。
图1
内窥镜mfi系统概述。左上方显示了将五激光束组合到照明光纤（if）中的近端照明系统。左下方显示了通过显微镜物镜（obj.），滤光轮（fw）成像到检测器（det.）上的cfb近端表面成像的近端照明系统。右边是远端的放大模型，其顶部显示锥形if，底部显示cfb的成像镜头，两者均与套圈的远端齐平。未显示保护盖板。
2.1.1.近照度接近地，五激光束被准直，共对准并聚焦到照明光纤（if）中。这两个紫外线波长是由前面所述的脉冲，倍频和三倍变绿变石激光器产生的。406、515和642nm波长由单模尾纤二极管激光器（型号：lp406-sf20，lp520-sf15和lp642-sf20，thorlabs，newton，new jersey）提供，每个激光器均带有一个温度控制二极管驱动程序（cld1010lp，thorlabs）。每个可见光激光器均通过可调聚焦准直仪（cfc-11x-a，thorlabs）进行准直。使用一系列四个二向色镜（型号：zt594rdc，zt488rdc，zt375rdc，chroma technology corp，贝娄瀑布，佛蒙特州和型号ff310-dio1，semrock inc.，罗彻斯特，纽约）组合光束。642 nm激光是参考光束，并穿过所有二向色镜。使用透射较长波长并反射较短波长的二向色镜，将每个随后的较短波长与红光束共对准，从而在第四分色镜之后，将所有五激光束共对准。
然后，将同心的光束路径聚焦到if中。根据直径和高的uv到vis透射要求，所使用的if是具有0.22数值孔径（na）的高oh硅纤芯光纤（fip100110125，polymicro，亚利桑那州凤凰城），100 μm核心和od 125 μm。没有检测到来自中频的自发荧光，这会降低系统信噪比。主耦合透镜是一对未镀膜的平凸20 mm焦距氟化钙透镜（la5315，thorlabs）。使用一对透镜而不是单个透镜提供了两个主要优点，但代价是一个缺点。裂隙透镜可显着降低球面像差，这是将激光聚焦到透镜上所必需的。100 μm芯纤维。此外，直径4至4.5mm的激光束需要有效焦距为约10 mm以匹配0.22-na光纤镜头对的有效焦距为9.8mm，焦距为20mm的镜头很容易就可以买到，而等效的单镜头则没有。但是，由于光谱范围较宽，所以这些透镜没有镀膜，因此使用一对透镜会增加菲涅耳反射的损耗。尽管氟化钙的色散较低，但这些镜片仍需要进行纵向色差校正。375 nm光束的焦点位置用作参考焦点距离。可见光束上的可调焦点准直器有效地用作弱正透镜，以独立地将每个可见光束焦点与375 nm光束焦点匹配。通过放置负200mm防紫外线镀膜的熔融石英透镜（250-325，edmund optics，barrington，分光镜之前的光束路径中。假设光束直径为4.5mm，则该设计理论上将所有五个光束聚焦到同一位置，且均方根半径在5.5至15.5 μm并匹配if。100 μm核心，将22-na光纤放置在焦点上方，以耦合光而不会损坏光纤表面。这种简单的设计使用廉价的球面光学器件将激光耦合到if中，可以提供足够的性能和合理的传输。使用单涂层非球面镜可以实现出色的透射率。
2.1.2.远端照明远端照明必须*照亮远端成像物镜成像的ffov。具有必需光谱传输范围和od的多模光纤无法提供足够的na来照亮70度ffov。因此，if远侧输出照明角度需要修改。if与成像光轴不同轴，因此照明角度必须略大于70度成像场。因此，期望的输出na至少为0.6，对应于73.7度的照明ffov。光纤的光阑大致恒定，这意味着随着光纤输出面的面积减小，输出na可以增加。减少纤维表面积36.7 μm直径将输出na增加到0.6。光纤的末端是锥形的，以满足该规格。
原型设计目前在照明或成像光纤上均不包括盖板。初步分析表明，在照明和成像通道上方使用单盖板将导致if离开盖板的背反射进入照明na大于0.25的成像通道。对于临床设备，光通道将需要保护。这可以通过为照明和成像通道使用单独的盖板或为if使用带有突出通道的单盖板来完成。
2.1.3.远端影像为了在输卵管和卵巢表面提供良好的导航性能，远端成像镜头设计必须成像70度ffov并具有长焦距。另外，镜片必须成像375至642 nm的宽光谱范围，以获取荧光和反射率图像。从物理上讲，镜头设计仅限于300 μm直径元素具有合理的厚度和曲率，以降低制造和施工复杂性。
终的光学设计是定制的三元素镜片（图2），然后将其成像到具有3000个元素的cfb（fujikura figh-03-215s）。从远端到近端，镜片元件材料为s-fpm3，s-fpl51y和蓝宝石。为了进行初步的概念验证，未镀膜镜片。cfb的涂层直径为285 μm，图像圆直径190 μm，0.4 na和典型的3.1芯至芯间距3.4 μm。对于小于390 nm的波长，光的衰减会显着增加，但在375 nm处，内窥镜所需的大长度为几米。cfb中的元素数量从根本上限制了系统的空间分辨率。在过去的生育力内窥镜中，具有3000个元素的cfb在输卵管中提供了足够的图像分辨率。
图2
定制三元件远端成像镜头。缩小视图（底部）显示了在5mm的标称工作距离（wd）时的6.38mm ffov。镜头总长度为0.88mm，镜头外径为0.3mm。还显示了聚焦在cfb上的镜头的放大图（顶部）。cfb（蓝色）的像圈直径为0.19mm。
小值3.1 μm cfb的磁芯间距对应于大奈奎斯特截止频率161 次/ mm。终的镜头设计是f/ 2.4并在cfb的奈奎斯特截止点上实现40％调制传递函数（mtf）对比度，用于多色成像，对70度ffov范围内的所有光线以及从3 mm到无限远的所有工作距离进行多色成像。在范围之外时，对于短至1.2 mm的工作距离，对比度保持在30％以上。在光纤的频率截止处，mtf对比度高于20％应该足以成像。镜头设计有额外的性能缓冲器，以解决下面讨论的对准公差。图中显示了标称工作距离为5 mm时设计的多色mtf。图3。在大多数情况下，该透镜将用于成像单波长反射率或特定的荧光发射带，而不是整个设计波长范围。在这些情况下，mtf得到了进一步的改进，因为许多降级都来自整个光谱范围内的色差。可以在每个波长处对系统进行校准，以便在融合进行分析时可以对在不同波长带处顺序采集的图像进行数字色彩校正。
三元件透镜设计的多色mtf，工作距离为5 mm。垂直轴是光学传递函数的模量，水平轴是空间频率，以每mm周期为单位。光纤束的小芯对芯间距对应于大频率截止约160mm。
普通的安装和对准技术几乎不可能以微型规模实现，而需要以适度的结构对准公差来维持足够的成像性能。假定这些元素的大半径和厚度偏差为30 μm，球形和散光不规则度为0.2条纹，折射率误差为0.001，阿贝偏差为1％。确定建筑公差为大30 μm所有元素在任一轴上的偏心距和1度倾斜角度。使用这些参数在5 mm的额定工作距离和450 nm的波长下进行了1000次运行的monte carlo灵敏度分析。测得的性能标准是频率截止时的平均mtf161 次/ mm，其标称值为0.629。如果没有任何焦点补偿，则耐受后的平均mtf预计为0.597，其中90％的试验超过0.554。换句话说，即使具有适度的结构公差，频率截止处的平均对比度也有望下降< 8 ％ 在超过90％的建筑中< 3 ％在超过50％的版本中。因此，在构造之后，透镜系统应保持足够的成像性能，直至光纤的截止频率。
该设计优先考虑校正球差，彗差，轴向色度和像散。畸变是显着的剩余像差，其次是场曲和横向颜色。这些像差是可以接受的，因为在对输卵管内部的非平面几何成像时，分辨率（以及检测能力）比忠实再现平坦均匀的场域更为重要。每个单独的图像使用单个激发波长和窄发射带。因此，横向颜色将不是每个图像中的问题，而是可以用用于合成图像组合的软件进行校正的问题。失真不会降低图像清晰度，并且对于宽70度ffov是可以接受的折衷方案。另一个设计功能包括图像空间远心，190 μm匹配cfb。
镜头中的三个元素是堆叠的，并且仅包含两个的非平面表面。堆叠设计使透镜可以掉入套圈的mfi成像通道中，并通过光纤束向近端固定，并通过盖板向远侧固定，从而简化了结构。通过简化构造和制造测试，仅使用两个的非平面曲率可降低成本。镜头组件的长度为0.88mm，留有足够的空间将cfb固定在镜头后方3mm长的套圈中。预期该刚性长度不会损害曲折解剖结构中的跟踪和导航。
2.1.4.近端成像纤维束的近端面用改良的显微镜成像。无限校正，紫外线增强，20×物镜（uapo/340 20×/0.75)（日本东京奥林巴斯）与焦距为151.5mm的紫外线校正消色差管透镜（027-3025，optosigma，圣安娜，加利福尼亚）一起使用。奥林巴斯的物镜放大倍数是在假定焦距为180 mm的套筒透镜的情况下的。焦距较短的套筒透镜会导致整体放大倍率降低20×至16.8×。该探测器（新泽西州阿克顿市普林斯顿仪器公司的pixis 1024）具有13 × 13 μm像素的典型单像素阱深度为100 ke-。在此配置中，3.1 μmcfb的芯到芯间距为52.2 μm在对应的检测器上〜四每个核心到核心间隔的检测器像素，超过了奈奎斯特采样要求。在物镜和管透镜之间的无穷大空间中，可以使用10位置滤光轮（fw）（lb10w-3985，萨特仪器，加利福尼亚州诺瓦托）选择特定的发射带进行荧光成像，或者在开放位置允许反射成像。滤波器位置之间的小切换时间为55 ms。
2.2.图像处理使用winview（princeton instruments）将图像记录为16位灰度图像。使用图像分析软件（美国国立卫生研究院imagej）和matlab（马萨诸塞州内蒂克的mathworks）对单个图像进行处理。对于所有图像，将纤维束图像圆以外的像素值设置为0。对图像圆内的像素进行对比度增强，以将亮的1％像素和暗的1％像素分别设置为大和小强度价值观。增强对比度后，通过在不降低分辨率的情况下减轻cfb的像素化效果，应用轻微的高斯模糊以增加视觉感知。通过将蓝色通道的406 nm照明，绿色通道的515 nm照明和红色通道的642 nm照明进行加权组合来创建颜色反射率图像。定性地调整每个通道的权重，以匹配对准确色彩再现的感知。彩色荧光图像使用从窄带450-，532-和590-nm发射滤光片收集的光。所有发射滤光片的全宽近似大值为10 nm。通过组合三个发射滤镜图像并定性加权通道以近似视觉颜色强度来创建合成图像。
2.3.成像系统测试对mfi成像系统的分辨率和视野进行了表征，并与理论仿真进行了比较。另外，评估了成像系统产生伪白光图像和捕获荧光图像的能力。
2.3.1.成像分辨率测试将成像透镜参数和近似纤维束参数建模为一个完整的系统（成像仪，五个焦距，博尔德，科罗拉多州），以确定在1、3、5、7和10 mm的工作距离处的预期小可分辨特征尺寸和fov 。
对于每个工作距离，已构造的内窥镜对在目标中心和边缘的usaf测试目标上的条形目标进行成像。用白光对测试目标进行透射照明，并且无需发射滤镜即可获得灰度图像。如上所述，以1.4像素的高斯模糊半径对所得图像进行处理。
通过在每个位置的分辨率截止点附近对一系列条形目标进行成像，可以在轴上和视野边缘评估分辨率。视场的边缘被认为是半径的十分之九，以使条形目标合理地适合于fov。在每个目标的水平和垂直条上绘制一个代表性的轮廓，并测量调制频率。两点的瑞利分辨率标准峰强度和谷强度之间的下降26.4％。调制对比度由以下公式给出：
调制对比度=(imax−imin)imax+imin.
因此，瑞利标准对应于15.21％的调制对比度。垂直和水平条的调制对比度都大于或等于15.21％的条目标被认为是可分辨的。对于每个工作距离，将小可分辨条的宽度与建模的小可分辨特征尺寸进行比较。
白光照明下的测试应提供与多色mtf类似的结果图3。实际上，该系统被设计为主要对窄带荧光或反射率成像。cfb的频率截止从根本上限制了任何给定工作距离下的大分辨率。但是，窄带成像将减少色差，从而在cfb的频率截止处（特别是在离轴高频时）增加mtf。因此，在窄带成像配置中，分辨率不会提高，但是对比度和图像质量可能会提高。
2.3.2.成像视场测试通过在每个工作距离以每mm一个线对的方波对成像进行成像，来测量所构造的内窥镜的fov。用白光对目标进行透射照明，并且无需发射滤镜即可获得灰度图像。这些线对用于在每个工作距离处测量以mm为单位的近似fov，并将其与模拟值进行比较。
2.3.3.荧光标准成像内窥镜对荧光成像的能力通过对磺基若丹明，荧光素和硫酸奎宁（表格1）。稳定且特性良好的染料是测试的理想选择。它们在与生物软组织相似的波长范围内发出荧光，并被稀释为强度类似于组织自发荧光的荧光。三个比色皿并排放置，并且五色照明激光束旨在穿过所有三个样品瓶。将成像内窥镜垂直于激光束放置，以便可以对每个小瓶内的激光束路径成像。对于除642 nm以外的每个照明波长，使用窄带发射滤光片分别在450、532和590 nm处记录了三幅图像。在没有发射滤光片的情况下记录了第四张图像。如上所述处理图像。使用过滤后的图像创建了定性的复合彩色图像。对于合成彩色图像，590-nm滤光片图像映射到十六进制feb900给出的橙色，以匹配荧光信号的视觉感知。450和532 nm图像分别映射到蓝色和绿色通道。
表格1用于测试的荧光染料及其浓度和溶解溶剂。
染料 溶剂 浓度 （μm）
sr 乙醇 0.8
qs 50 h2so4 2
fl 0.1 m氢氧化钠 0.2
注意：sr，磺基若丹明；qs，硫酸奎宁；f1，荧光素。
3.结果3.1.成像分辨率和视野在3至10 mm的工作距离范围内，测得的小可分辨特征尺寸与模型值相比具有优势（图4）。图中显示了3、5和10 mm的轴上钢筋目标测试的样本图像图5。在1mm的工作距离上，内窥镜几乎无法在轴上分辨测试目标上的小条形（第3组，元素6）。根据mtf的预期，在所有工作距离下的离轴性能都比在轴上差。在与分辨率相同的工作距离下测量fov。它始终比模型值小一些，如图4。
在1、3、5、7和10 mm的工作距离下，测得的分辨率和fov与建模值进行了比较。
图5
来自轴分辨率测试的样本图像。左侧的图像是所使用的1951 usaf测试目标的数码相机图像。以下从左到右的三幅图像是使用内窥镜在3、5和10 mm的工作距离处获取的测试目标的图像。小可分辨特征分别确定为第3组元素1，第2组元素3和第1组元素5。
3.2.荧光成像可以看到荧光素，硫酸奎宁和磺基罗丹明的成像结果。图6染料的吸收特性在表2。由于占终图像强度的重要变量包括照明功率和带宽，照明光吸收，荧光团量子产率和浓度，荧光发射光谱，发射滤光片光谱，光学系统光谱响应和图像处理，因此该图不是定量的。在每个照明波长处染料的荧光强度的定性比较与基于近似量子产率的预测非常吻合。发射滤光片还成功地阻挡了带外照明光，该可见光在没有可见光滤光片的情况下可以在图像中看到。
表2每种荧光染料的吸收和发射特性。对于每种照射波长，给出了每种染料的吸收百分比。将每种染料的百分比归一化，以使峰值吸收波长为100％。还提供了发射光谱的峰值波长和光谱宽度的一半大值。
染料
sr qs fl
吸收率（％）
250纳米 14.5 100.0 29.1
375纳米 5.3 15.1 1.6
406纳米 1.5 0.4 1.8
515纳米 9.5 0.0 13.1
发射（nm）
峰值 593 449 515
fwhm 34 94 38
注意：sr，磺基若丹明；qs，硫酸奎宁；f1，荧光素。
图6
1厘米宽比色皿中的荧光染料图像。从左到右，比色皿包含磺基若丹明，硫酸奎宁和荧光素。图像的每一行对应于所使用的四个照明波长之一。左边的一列是用数码相机拍摄的图像。白色圆圈代表内窥镜的近似fov。从左至右，中间的四列是使用不带450纳米，532纳米和590纳米发射滤光片的内窥镜拍摄的图像。右边的一栏是450、532和590 nm发射滤光片图像的彩色合成图像。
3.3.彩色影像为了测试rgb成像模式，使用可见光光源对彩色物体进行了连续成像，并使用imagej将反射率图像合成为彩色合成物。图7在名片上显示了亚利桑那大学徽标的彩色合成图像，该图像忠实再现了饱和的红色和蓝色。还通过对猪的卵巢和输卵管组织进行切片成像来测试彩色荧光成像（图7）。该组织是从亚利桑那州的机构动物护理和使用委员会批准的方式从当地的屠宰场获得的。用375 nm的光照射组织，并使用450、532和642 nm的发射滤光片对其进行连续成像。然后将三个荧光图像合并为合成彩色图像。
左图是使用数码相机拍摄的，并且是（a）名片上的亚利桑那大学徽标，以及（c）包括生殖腔，卵泡和输卵管的猪生殖系统的一部分（左上）。内窥镜拍摄的相应图像在右侧，fov由覆盖在左侧图像上的圆圈近似。图像b是通过依次获取405、515和642 nm照明的图像而拍摄的合成色反射图像。图像d是使用375 nm激发创建的合成彩色荧光图像，并使用450、532和590 nm发射滤光器顺序采集图像。
4.讨论已经建立了一种微型*，该系统能够使用紫外线和可见光进行自发荧光或伪白光成像模式进行大范围导航。*构造的内窥镜集成300 μm直径的镜头和独立的照明通道成一个790 μm od包，用于人类输卵管。宽视场，在大景深范围内具有良好的成像性能，是导航的理想选择。与标准白光相机相比，执行自发荧光成像的功能可以提高对癌症的敏感性。在规定的尺寸范围内以及在所需的波长范围内实现成像规格提出了重大挑战，但是，演示的原型能够满足规格要求，并具有模块化，灵活的设计，可用于将来的内窥镜。
小型且柔性的内窥镜可以被修改以用于其他应用，例如通过小口径皮下注射针插入。内窥镜的机械设计具有转向功能以及其他功能125 μm内腔具有其他功能，例如高分辨率oct成像。可以定制照明系统，以根据应用需要包括从250 nm到可见光谱的任何激光波长。也可以将近红外照明合并到系统中，但是如果与250 nm照明一起使用，则可能需要定制二向色镜涂层。设计用于反射250 nm并透射更长波长的现成二向色镜通常在近红外中具有高透射损耗。专门执行荧光成像的系统可能能够将照明和成像组合成单个路径，从而获得更小的尺寸。但是，在单路径配置中，uv照明波长将受到cfb衰减的限制。
当暴露在紫外线照射下时，成像镜头和套圈材料不会显示荧光。组织自发荧光信号通常非常低，并且来自材料的任何其他荧光都会将信噪比降低到不可接受的水平。目前，此要求消除了用于注塑，3-d打印，金刚石车削或grin材料的塑料或聚合物。紫外线波长要求也限制了近端成像系统。假设具有合理的紫外线透射率的cfb可用，那么将cfb的表面中继到检测器的系统将需要的显微镜物镜和管形透镜才能在340 nm以下透射。当在更宽的光谱范围内成像时，色差和检测器光谱响应范围可能是其他问题。
在内窥镜达到模拟分辨率时，fov小于预期。差异可能是由于多种原因造成的。可能的原因是cfb的图像圈大小。它被为190 + 20 μm。镜头设计为远心影像空间。此功能可地减小cfb的入射角依赖性，并在整个图像上提供均匀的照明。远心度还意味着70度视场旨在成像到190 μm直径圆。因此，在5mm的工作距离处，预期的ffov为7.22mm（66度）。如果图像圆缩小到170 μm直径，则成像的ffov将为5.72mm（58度），而210 μm图像圆将对应于7.91mm（75度）的ffov。在5mm的工作距离处测得的ffov为6mm，在公差范围内。纤维束图像圆直径的变化将在分辨率上进行权衡。光纤的数量保持恒定，因此较小的像圈将减少光纤的平均芯到芯间距，从而提高分辨率。这与针对建模分辨率的良好测量结果是一致的，并且可以解释在10mm工作距离下优于建模分辨率的性能。镜头的理论性能设计过高，因此，对准良好的镜头系统仍将光纤限制为像圈尺寸为220 μm，对应于5mmwd（80度）下的8.65mmffov。较大的视场将开始被的晶状体的边缘夹住，这可能会导致不希望的杂散光反射。可能导致ffov降低的其他因素是透镜对准和透镜制造公差。
内窥镜的终目标是用作检测卵巢癌和其他可通过小直径管腔（例如胰管或胆管）到达的组织中其他疾病的有效筛选方法。实现该目标是一个多步骤的过程。此处介绍的代内窥镜成功证明了mfi成像可以小型化，从而可以在亚视中提供广域功能成像。800 μm直径包装。下一步是改进设计，以便可以快速可靠地构建坚固的内窥镜，以在有限的人体试验中提供安全的实时成像。第二代系统的光学工程挑战是简化，缩小和自动化近端光学系统。
为了在手术环境中使用，内窥镜需要坚固且可消毒，而近端系统则需要紧凑且便携以便集成到手术车中。以前一直缺乏简单，紧凑的紫外线源，特别是对于短于315 nm的波长。当前原型中的uv波长由内部定制的大型激光器提供。尽管光束质量足以传送紧凑光纤的uv-b和uv-c光源仍然难以实施，但二极管和dpss激光器以及led技术的发展已使紧凑，坚固，低功率的uv-a光源成为可能。一个现实。现在可以构建一个非常紧凑的光源，其波长范围从近紫外线到近红外。一些较新的光源允许足够短的开/关调制，从而可以通过计算机轻松地自动化捕获与每个照明波长的探测器采集同步的图像序列的过程。
近端成像光学系统目前使用具有10位高速fw的改进型显微镜支架。该设计允许快速更换发射滤光片，以使用原型设备优化波长组合，而以实时成像为代价。手术过程中出现的理想图像组合需要妇科医生的进一步发展。一旦确定了理想的滤光带，就可以使用原型系统构建针对实时成像优化的第二代近端成像系统。
例如，图7（d）（猪假色荧光）需要三幅图像，每幅图像都要经过60秒的曝光才能使用窄带（约10 nm fwhm）发射滤镜。先前在实验室进行的体外mfi组织成像研究成功地使用了带宽为35至100 nm的发射滤光片。用市售的高透射率代替干涉滤光片50 +纳米带宽的滤光片将使近端系统的光收集效率提高一个数量级。通过将fw和单色检测器替换为能够同时成像所有波长带的快照多光谱成像相机，可以实现成像速度的另一个数量级增益。购买或构建这样的系统超出了此原型构建的范围。成像速度的优势实际上是双重的。图像采集时间的直接减少是由于在一次曝光中收集了所有光谱信息并消除了滤镜切换的时间延迟。激发光的大安全暴露极限必须仅考虑一次暴露，而不是多次暴露。因此，该技术的成像速度的第二个优点是安全地增加照明强度，以进一步减少足够的光收集所需的曝光时间。同时采集的终优势是消除了连续图像之间的运动伪像。通过将ar涂层添加到远端和近端mfi光学器件，可以进一步提高光收集效率。〜41 ％到10％这三个主要变化以及其他小的优化措施对于在第二代设备中实现实时mfi成像将是必需的。
一些政府监管机构和其他组织，包括非电离辐射防护委员会（icnirp），发布了眼睛和皮肤的辐射暴露限值。这些是对内部组织的进一步研究，它们是的可用指南。375和250 nm的光限制为39,000和7毫焦/ 厘米2，对于靠近内窥镜的组织，功率密度。假设组织在筛选过程中以1 mm的工作距离暴露于紫外线辐射下多1分钟，则平均激光功率的限制是在375 nm处为5.1 mw，在250 nm处为0.001 mw。猪的组织图7（d）是在375 nm激发下以相似的平均激光功率成像的，但工作距离为约10mm 。在更长的工作距离下，获取三张连续图像的估计总曝光量为<2％375 nm处的极限值可以通过实施上述优化进一步降低。满足250 nm激发下的暴露极限将具有挑战性，并且需要优化系统效率。
此处介绍的设备实现了初始的概念验证目标。在第二代实施讨论的变更将允许进行有限的人体试验，以进一步验证和完善该技术。对于具有第三代设备的高风险患者，长期的大型临床试验对于确定常规筛查技术的实际疗效很有必要。
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1.简介某些疾病的早期检测和诊断受到在深埋器官中获得高分辨率图像的能力的限制。例如卵巢癌，这是致命的女性生殖恶性肿瘤。卵巢癌通常表现出非特异性症状，目前的筛查方法（体格检查，经阴道超声，ca-125血液检查）在大型临床试验中用于一般人群的年度筛查已被证明不可靠或无效。由于缺乏明显的症状以及该疾病致命的表型（高级别浆液性卵巢癌（hgsoc））的特殊自然史，在及早发现阶段以使结果产生显着差异是有问题的。模型表明，hgsoc存在于一个隐匿无症状形式为3至4年，其中它太小，通过分泌的生物标记物，磁共振成像，计算机断层扫描来检测，并且可能超声波，随后迅速生长阶段在第4至5年出现症状时，此时肿瘤已经转移并致死。
新兴的共识表明，hgsoc的很大一部分（可能超过50％）实际上起源于输卵管，随后迁移到卵巢和腹膜。如果这个假设是正确的，那么它将通过使用相对便宜但坚固的光学组件通过微创内窥镜对疾病进行早期检测打开一个窗口。光学成像可以对疾病进行定位，并可以在需要侵入性*之前从可疑的血液标记物中确认诊断。高分辨率光学技术可能具有在早期检测所需的分辨率水平上产生结构和功能信息的能力，但自由空间光学器件无法透皮穿透人体并进入足够的深度。光纤和自由空间组件的小型化允许集成到微创内窥镜中。
人体通过阴道，子宫颈和子宫提供一条自然途径，以进入输卵管和卵巢。输卵管的近端输卵管开口位于子宫内，口直径为约1 mm。然后，管子扩张到大管内直径为约1 厘米在整个12至15厘米的曲折路径中，菌丝将管子连接到子房。以前，简单的白光成像内窥镜（称为输卵管镜）的外径（od）小于一mm，以前已经在体内对输卵管成像，以阻止生育。这些输卵管镜是通过*的工作通道引入的。通过连接到相干光纤束（cfb）的镜头进行成像。设计用于输卵管阻塞性*的输卵管镜缺乏足够的成像性能，无法筛查早期卵巢癌所表现出的细微变化。
筛检型输卵管镜的导航部分应采用宽视野（fov）进行前视，并且应采用大800 μm od。前视广角内窥镜具有三种主要技术，可将图像从远端传输到计算机：光纤束，微型检测器和光学扫描。现在，许多现代内窥镜直接在内窥镜中使用微型cmos检测器。微型探测器0.5 mm× 0.5 mm尺寸已被证明和1 mm× 1 mm检测器是可商购的。随着技术的不断萎缩，它可能是可行的。800 μm od内窥镜，但当前不是一个选择。诸如压电扫描光纤（sf）内窥镜之类的扫描技术也在继续缩小。1.2 mm的实现方式已用于对1 cm的远端输卵管进行体内成像。该技术具有明显的光学优势和有效的像素密度，但需要进一步的小型化才能进一步插入输卵管。的前视内窥镜成像技术使用cfb。内窥镜中的透镜将图像成像到cfb的远端表面上，然后在体外分离成像系统将cfb的近端图像成像到检测器上。对于亚mm直径的内窥镜，cfb方法仍然是可行的技术，但是与任何摄像头系统一样，在fov和分辨率之间需要权衡。输卵镜的有限尺寸限制了cfb像素的数量，从而损害了以接近细胞分辨率同时执行广域导航的能力。然而，
荧光成像可用于可视化组织化学成分的变化，非常适合于宽视场成像。特别是内源性荧光团（*，胶原蛋白，*腺嘌呤二核苷酸+氢等）在正常和异常组织中的浓度可能不同。使用紫外线和短波可见光激发源，可以在组织中激发不同的荧光团。正常，良性和癌性卵巢组织之间的内源性荧光差异已由研究人员和其他人使用光纤探针在体内和离体进行了表征和广域自发荧光成像。多光谱荧光成像（mfi）可以在反射率和荧光模式下成像，以测量光吸收或荧光发射，这两者都可以指示分子变化（血红蛋白或荧光团浓度的变化）或组合多个反射率图像用于伪白光成像。
先前已经证明了双模态光学相干断层扫描（oct）和荧光成像内窥镜。阿2.1-mm直径的sf内窥镜外源荧光团的多光谱荧光成像已经证实没有uv激发或oct能力。初步研究在使用1.2mmsf内窥镜对输卵管进行体内白光成像方面取得的成功有限。较大直径的装置难以穿过管子。直径为几百微米的侧视式探针也已被证明仅使用oct并使用双包层光纤进行oct和单点荧光检测。直径为几mm的其他内窥镜将荧光成像和oct的各种实现方式结合在一起。这些示例均未将宽视野荧光成像和oct组合到亚mm直径的包装中。此外，这些示例均未包含将mfi用于广域自发荧光检测的uv激发。
使内窥镜使用的宽视野mfi小型化是验证该技术在体内使用的下一步。在本文中，我们描述了小型mfi系统的光学设计和表征，以及将其集成到微型系统中的过程。800 μm直径输液镜原型。
2.设计与方法2.1.光学设计mfi光学设计由四个具有独立且相互关联的规格的光学子系统组成（图1）。遵循光的路径，四个光学子系统分别是：近端照明，远端照明，远端成像和近端成像。为了有效导航，全视场（ffov）的总体系统规格为70度。根据以前的研究，包括的照明波长为250、375、406、515和642 nm。激光源用于内窥镜原型，其中心波长与我们先前对离体卵巢和输卵管组织的mfi成像研究中的过滤氙弧灯提供的中心波长相似。紫外线和蓝色波长可有效激发内源性荧光团。在反射模式下以375、406和515 nm采样血液吸收曲线也可以提供诊断工具。后，通过获取并组合具有406、515和642 nm照明波长的图像序列，可以获得伪白光成像。包括250 nm光在内的宽光谱范围以及执行反射率和荧光成像的要求都需要单独的激发和照明通道。成像通道针对375至642 nm的成像进行了优化。因此，250-nm照明仅用于荧光模式，但是所有其他照明波长都可以用于反射率或荧光模式。为了适应大外径为的柔性内窥镜的集成800 μm，照明和成像通道限制为125 - 300 μm直径。套圈，拉线和保护套所需的剩余空间。具有类似机械设计但不具有mfi功能的内窥镜的机械和操纵细节已在之前发布。但是，设计确实允许125 μm直径的管腔，用于将来的其他功能，而又不超过总外径的要求。
图1
内窥镜mfi系统概述。左上方显示了将五激光束组合到照明光纤（if）中的近端照明系统。左下方显示了通过显微镜物镜（obj.），滤光轮（fw）成像到检测器（det.）上的cfb近端表面成像的近端照明系统。右边是远端的放大模型，其顶部显示锥形if，底部显示cfb的成像镜头，两者均与套圈的远端齐平。未显示保护盖板。
2.1.1.近照度接近地，五激光束被准直，共对准并聚焦到照明光纤（if）中。这两个紫外线波长是由前面所述的脉冲，倍频和三倍变绿变石激光器产生的。406、515和642nm波长由单模尾纤二极管激光器（型号：lp406-sf20，lp520-sf15和lp642-sf20，thorlabs，newton，new jersey）提供，每个激光器均带有一个温度控制二极管驱动程序（cld1010lp，thorlabs）。每个可见光激光器均通过可调聚焦准直仪（cfc-11x-a，thorlabs）进行准直。使用一系列四个二向色镜（型号：zt594rdc，zt488rdc，zt375rdc，chroma technology corp，贝娄瀑布，佛蒙特州和型号ff310-dio1，semrock inc.，罗彻斯特，纽约）组合光束。642 nm激光是参考光束，并穿过所有二向色镜。使用透射较长波长并反射较短波长的二向色镜，将每个随后的较短波长与红光束共对准，从而在第四分色镜之后，将所有五激光束共对准。
然后，将同心的光束路径聚焦到if中。根据直径和高的uv到vis透射要求，所使用的if是具有0.22数值孔径（na）的高oh硅纤芯光纤（fip100110125，polymicro，亚利桑那州凤凰城），100 μm核心和od 125 μm。没有检测到来自中频的自发荧光，这会降低系统信噪比。主耦合透镜是一对未镀膜的平凸20 mm焦距氟化钙透镜（la5315，thorlabs）。使用一对透镜而不是单个透镜提供了两个主要优点，但代价是一个缺点。裂隙透镜可显着降低球面像差，这是将激光聚焦到透镜上所必需的。100 μm芯纤维。此外，直径4至4.5mm的激光束需要有效焦距为约10 mm以匹配0.22-na光纤镜头对的有效焦距为9.8mm，焦距为20mm的镜头很容易就可以买到，而等效的单镜头则没有。但是，由于光谱范围较宽，所以这些透镜没有镀膜，因此使用一对透镜会增加菲涅耳反射的损耗。尽管氟化钙的色散较低，但这些镜片仍需要进行纵向色差校正。375 nm光束的焦点位置用作参考焦点距离。可见光束上的可调焦点准直器有效地用作弱正透镜，以独立地将每个可见光束焦点与375 nm光束焦点匹配。通过放置负200mm防紫外线镀膜的熔融石英透镜（250-325，edmund optics，barrington，分光镜之前的光束路径中。假设光束直径为4.5mm，则该设计理论上将所有五个光束聚焦到同一位置，且均方根半径在5.5至15.5 μm并匹配if。100 μm核心，将22-na光纤放置在焦点上方，以耦合光而不会损坏光纤表面。这种简单的设计使用廉价的球面光学器件将激光耦合到if中，可以提供足够的性能和合理的传输。使用单涂层非球面镜可以实现出色的透射率。
2.1.2.远端照明远端照明必须*照亮远端成像物镜成像的ffov。具有必需光谱传输范围和od的多模光纤无法提供足够的na来照亮70度ffov。因此，if远侧输出照明角度需要修改。if与成像光轴不同轴，因此照明角度必须略大于70度成像场。因此，期望的输出na至少为0.6，对应于73.7度的照明ffov。光纤的光阑大致恒定，这意味着随着光纤输出面的面积减小，输出na可以增加。减少纤维表面积36.7 μm直径将输出na增加到0.6。光纤的末端是锥形的，以满足该规格。
原型设计目前在照明或成像光纤上均不包括盖板。初步分析表明，在照明和成像通道上方使用单盖板将导致if离开盖板的背反射进入照明na大于0.25的成像通道。对于临床设备，光通道将需要保护。这可以通过为照明和成像通道使用单独的盖板或为if使用带有突出通道的单盖板来完成。
2.1.3.远端影像为了在输卵管和卵巢表面提供良好的导航性能，远端成像镜头设计必须成像70度ffov并具有长焦距。另外，镜片必须成像375至642 nm的宽光谱范围，以获取荧光和反射率图像。从物理上讲，镜头设计仅限于300 μm直径元素具有合理的厚度和曲率，以降低制造和施工复杂性。
终的光学设计是定制的三元素镜片（图2），然后将其成像到具有3000个元素的cfb（fujikura figh-03-215s）。从远端到近端，镜片元件材料为s-fpm3，s-fpl51y和蓝宝石。为了进行初步的概念验证，未镀膜镜片。cfb的涂层直径为285 μm，图像圆直径190 μm，0.4 na和典型的3.1芯至芯间距3.4 μm。对于小于390 nm的波长，光的衰减会显着增加，但在375 nm处，内窥镜所需的大长度为几米。cfb中的元素数量从根本上限制了系统的空间分辨率。在过去的生育力内窥镜中，具有3000个元素的cfb在输卵管中提供了足够的图像分辨率。
图2
定制三元件远端成像镜头。缩小视图（底部）显示了在5mm的标称工作距离（wd）时的6.38mm ffov。镜头总长度为0.88mm，镜头外径为0.3mm。还显示了聚焦在cfb上的镜头的放大图（顶部）。cfb（蓝色）的像圈直径为0.19mm。
小值3.1 μm cfb的磁芯间距对应于大奈奎斯特截止频率161 次/ mm。终的镜头设计是f/ 2.4并在cfb的奈奎斯特截止点上实现40％调制传递函数（mtf）对比度，用于多色成像，对70度ffov范围内的所有光线以及从3 mm到无限远的所有工作距离进行多色成像。在范围之外时，对于短至1.2 mm的工作距离，对比度保持在30％以上。在光纤的频率截止处，mtf对比度高于20％应该足以成像。镜头设计有额外的性能缓冲器，以解决下面讨论的对准公差。图中显示了标称工作距离为5 mm时设计的多色mtf。图3。在大多数情况下，该透镜将用于成像单波长反射率或特定的荧光发射带，而不是整个设计波长范围。在这些情况下，mtf得到了进一步的改进，因为许多降级都来自整个光谱范围内的色差。可以在每个波长处对系统进行校准，以便在融合进行分析时可以对在不同波长带处顺序采集的图像进行数字色彩校正。
三元件透镜设计的多色mtf，工作距离为5 mm。垂直轴是光学传递函数的模量，水平轴是空间频率，以每mm周期为单位。光纤束的小芯对芯间距对应于大频率截止约160mm。
普通的安装和对准技术几乎不可能以微型规模实现，而需要以适度的结构对准公差来维持足够的成像性能。假定这些元素的大半径和厚度偏差为30 μm，球形和散光不规则度为0.2条纹，折射率误差为0.001，阿贝偏差为1％。确定建筑公差为大30 μm所有元素在任一轴上的偏心距和1度倾斜角度。使用这些参数在5 mm的额定工作距离和450 nm的波长下进行了1000次运行的monte carlo灵敏度分析。测得的性能标准是频率截止时的平均mtf161 次/ mm，其标称值为0.629。如果没有任何焦点补偿，则耐受后的平均mtf预计为0.597，其中90％的试验超过0.554。换句话说，即使具有适度的结构公差，频率截止处的平均对比度也有望下降< 8 ％ 在超过90％的建筑中< 3 ％在超过50％的版本中。因此，在构造之后，透镜系统应保持足够的成像性能，直至光纤的截止频率。
该设计优先考虑校正球差，彗差，轴向色度和像散。畸变是显着的剩余像差，其次是场曲和横向颜色。这些像差是可以接受的，因为在对输卵管内部的非平面几何成像时，分辨率（以及检测能力）比忠实再现平坦均匀的场域更为重要。每个单独的图像使用单个激发波长和窄发射带。因此，横向颜色将不是每个图像中的问题，而是可以用用于合成图像组合的软件进行校正的问题。失真不会降低图像清晰度，并且对于宽70度ffov是可以接受的折衷方案。另一个设计功能包括图像空间远心，190 μm匹配cfb。
镜头中的三个元素是堆叠的，并且仅包含两个的非平面表面。堆叠设计使透镜可以掉入套圈的mfi成像通道中，并通过光纤束向近端固定，并通过盖板向远侧固定，从而简化了结构。通过简化构造和制造测试，仅使用两个的非平面曲率可降低成本。镜头组件的长度为0.88mm，留有足够的空间将cfb固定在镜头后方3mm长的套圈中。预期该刚性长度不会损害曲折解剖结构中的跟踪和导航。
2.1.4.近端成像纤维束的近端面用改良的显微镜成像。无限校正，紫外线增强，20×物镜（uapo/340 20×/0.75)（日本东京奥林巴斯）与焦距为151.5mm的紫外线校正消色差管透镜（027-3025，optosigma，圣安娜，加利福尼亚）一起使用。奥林巴斯的物镜放大倍数是在假定焦距为180 mm的套筒透镜的情况下的。焦距较短的套筒透镜会导致整体放大倍率降低20×至16.8×。该探测器（新泽西州阿克顿市普林斯顿仪器公司的pixis 1024）具有13 × 13 μm像素的典型单像素阱深度为100 ke-。在此配置中，3.1 μmcfb的芯到芯间距为52.2 μm在对应的检测器上〜四每个核心到核心间隔的检测器像素，超过了奈奎斯特采样要求。在物镜和管透镜之间的无穷大空间中，可以使用10位置滤光轮（fw）（lb10w-3985，萨特仪器，加利福尼亚州诺瓦托）选择特定的发射带进行荧光成像，或者在开放位置允许反射成像。滤波器位置之间的小切换时间为55 ms。
2.2.图像处理使用winview（princeton instruments）将图像记录为16位灰度图像。使用图像分析软件（美国国立卫生研究院imagej）和matlab（马萨诸塞州内蒂克的mathworks）对单个图像进行处理。对于所有图像，将纤维束图像圆以外的像素值设置为0。对图像圆内的像素进行对比度增强，以将亮的1％像素和暗的1％像素分别设置为大和小强度价值观。增强对比度后，通过在不降低分辨率的情况下减轻cfb的像素化效果，应用轻微的高斯模糊以增加视觉感知。通过将蓝色通道的406 nm照明，绿色通道的515 nm照明和红色通道的642 nm照明进行加权组合来创建颜色反射率图像。定性地调整每个通道的权重，以匹配对准确色彩再现的感知。彩色荧光图像使用从窄带450-，532-和590-nm发射滤光片收集的光。所有发射滤光片的全宽近似大值为10 nm。通过组合三个发射滤镜图像并定性加权通道以近似视觉颜色强度来创建合成图像。
2.3.成像系统测试对mfi成像系统的分辨率和视野进行了表征，并与理论仿真进行了比较。另外，评估了成像系统产生伪白光图像和捕获荧光图像的能力。
2.3.1.成像分辨率测试将成像透镜参数和近似纤维束参数建模为一个完整的系统（成像仪，五个焦距，博尔德，科罗拉多州），以确定在1、3、5、7和10 mm的工作距离处的预期小可分辨特征尺寸和fov 。
对于每个工作距离，已构造的内窥镜对在目标中心和边缘的usaf测试目标上的条形目标进行成像。用白光对测试目标进行透射照明，并且无需发射滤镜即可获得灰度图像。如上所述，以1.4像素的高斯模糊半径对所得图像进行处理。
通过在每个位置的分辨率截止点附近对一系列条形目标进行成像，可以在轴上和视野边缘评估分辨率。视场的边缘被认为是半径的十分之九，以使条形目标合理地适合于fov。在每个目标的水平和垂直条上绘制一个代表性的轮廓，并测量调制频率。两点的瑞利分辨率标准峰强度和谷强度之间的下降26.4％。调制对比度由以下公式给出：
调制对比度=(imax−imin)imax+imin.
因此，瑞利标准对应于15.21％的调制对比度。垂直和水平条的调制对比度都大于或等于15.21％的条目标被认为是可分辨的。对于每个工作距离，将小可分辨条的宽度与建模的小可分辨特征尺寸进行比较。
白光照明下的测试应提供与多色mtf类似的结果图3。实际上，该系统被设计为主要对窄带荧光或反射率成像。cfb的频率截止从根本上限制了任何给定工作距离下的大分辨率。但是，窄带成像将减少色差，从而在cfb的频率截止处（特别是在离轴高频时）增加mtf。因此，在窄带成像配置中，分辨率不会提高，但是对比度和图像质量可能会提高。
2.3.2.成像视场测试通过在每个工作距离以每mm一个线对的方波对成像进行成像，来测量所构造的内窥镜的fov。用白光对目标进行透射照明，并且无需发射滤镜即可获得灰度图像。这些线对用于在每个工作距离处测量以mm为单位的近似fov，并将其与模拟值进行比较。
2.3.3.荧光标准成像内窥镜对荧光成像的能力通过对磺基若丹明，荧光素和硫酸奎宁（表格1）。稳定且特性良好的染料是测试的理想选择。它们在与生物软组织相似的波长范围内发出荧光，并被稀释为强度类似于组织自发荧光的荧光。三个比色皿并排放置，并且五色照明激光束旨在穿过所有三个样品瓶。将成像内窥镜垂直于激光束放置，以便可以对每个小瓶内的激光束路径成像。对于除642 nm以外的每个照明波长，使用窄带发射滤光片分别在450、532和590 nm处记录了三幅图像。在没有发射滤光片的情况下记录了第四张图像。如上所述处理图像。使用过滤后的图像创建了定性的复合彩色图像。对于合成彩色图像，590-nm滤光片图像映射到十六进制feb900给出的橙色，以匹配荧光信号的视觉感知。450和532 nm图像分别映射到蓝色和绿色通道。
表格1用于测试的荧光染料及其浓度和溶解溶剂。
染料 溶剂 浓度 （μm）
sr 乙醇 0.8
qs 50 h2so4 2
fl 0.1 m氢氧化钠 0.2
注意：sr，磺基若丹明；qs，硫酸奎宁；f1，荧光素。
3.结果3.1.成像分辨率和视野在3至10 mm的工作距离范围内，测得的小可分辨特征尺寸与模型值相比具有优势（图4）。图中显示了3、5和10 mm的轴上钢筋目标测试的样本图像图5。在1mm的工作距离上，内窥镜几乎无法在轴上分辨测试目标上的小条形（第3组，元素6）。根据mtf的预期，在所有工作距离下的离轴性能都比在轴上差。在与分辨率相同的工作距离下测量fov。它始终比模型值小一些，如图4。
在1、3、5、7和10 mm的工作距离下，测得的分辨率和fov与建模值进行了比较。
图5
来自轴分辨率测试的样本图像。左侧的图像是所使用的1951 usaf测试目标的数码相机图像。以下从左到右的三幅图像是使用内窥镜在3、5和10 mm的工作距离处获取的测试目标的图像。小可分辨特征分别确定为第3组元素1，第2组元素3和第1组元素5。
3.2.荧光成像可以看到荧光素，硫酸奎宁和磺基罗丹明的成像结果。图6染料的吸收特性在表2。由于占终图像强度的重要变量包括照明功率和带宽，照明光吸收，荧光团量子产率和浓度，荧光发射光谱，发射滤光片光谱，光学系统光谱响应和图像处理，因此该图不是定量的。在每个照明波长处染料的荧光强度的定性比较与基于近似量子产率的预测非常吻合。发射滤光片还成功地阻挡了带外照明光，该可见光在没有可见光滤光片的情况下可以在图像中看到。
表2每种荧光染料的吸收和发射特性。对于每种照射波长，给出了每种染料的吸收百分比。将每种染料的百分比归一化，以使峰值吸收波长为100％。还提供了发射光谱的峰值波长和光谱宽度的一半大值。
染料
sr qs fl
吸收率（％）
250纳米 14.5 100.0 29.1
375纳米 5.3 15.1 1.6
406纳米 1.5 0.4 1.8
515纳米 9.5 0.0 13.1
发射（nm）
峰值 593 449 515
fwhm 34 94 38
注意：sr，磺基若丹明；qs，硫酸奎宁；f1，荧光素。
图6
1厘米宽比色皿中的荧光染料图像。从左到右，比色皿包含磺基若丹明，硫酸奎宁和荧光素。图像的每一行对应于所使用的四个照明波长之一。左边的一列是用数码相机拍摄的图像。白色圆圈代表内窥镜的近似fov。从左至右，中间的四列是使用不带450纳米，532纳米和590纳米发射滤光片的内窥镜拍摄的图像。右边的一栏是450、532和590 nm发射滤光片图像的彩色合成图像。
3.3.彩色影像为了测试rgb成像模式，使用可见光光源对彩色物体进行了连续成像，并使用imagej将反射率图像合成为彩色合成物。图7在名片上显示了亚利桑那大学徽标的彩色合成图像，该图像忠实再现了饱和的红色和蓝色。还通过对猪的卵巢和输卵管组织进行切片成像来测试彩色荧光成像（图7）。该组织是从亚利桑那州的机构动物护理和使用委员会批准的方式从当地的屠宰场获得的。用375 nm的光照射组织，并使用450、532和642 nm的发射滤光片对其进行连续成像。然后将三个荧光图像合并为合成彩色图像。
左图是使用数码相机拍摄的，并且是（a）名片上的亚利桑那大学徽标，以及（c）包括生殖腔，卵泡和输卵管的猪生殖系统的一部分（左上）。内窥镜拍摄的相应图像在右侧，fov由覆盖在左侧图像上的圆圈近似。图像b是通过依次获取405、515和642 nm照明的图像而拍摄的合成色反射图像。图像d是使用375 nm激发创建的合成彩色荧光图像，并使用450、532和590 nm发射滤光器顺序采集图像。
4.讨论已经建立了一种微型*，该系统能够使用紫外线和可见光进行自发荧光或伪白光成像模式进行大范围导航。*构造的内窥镜集成300 μm直径的镜头和独立的照明通道成一个790 μm od包，用于人类输卵管。宽视场，在大景深范围内具有良好的成像性能，是导航的理想选择。与标准白光相机相比，执行自发荧光成像的功能可以提高对癌症的敏感性。在规定的尺寸范围内以及在所需的波长范围内实现成像规格提出了重大挑战，但是，演示的原型能够满足规格要求，并具有模块化，灵活的设计，可用于将来的内窥镜。
小型且柔性的内窥镜可以被修改以用于其他应用，例如通过小口径皮下注射针插入。内窥镜的机械设计具有转向功能以及其他功能125 μm内腔具有其他功能，例如高分辨率oct成像。可以定制照明系统，以根据应用需要包括从250 nm到可见光谱的任何激光波长。也可以将近红外照明合并到系统中，但是如果与250 nm照明一起使用，则可能需要定制二向色镜涂层。设计用于反射250 nm并透射更长波长的现成二向色镜通常在近红外中具有高透射损耗。专门执行荧光成像的系统可能能够将照明和成像组合成单个路径，从而获得更小的尺寸。但是，在单路径配置中，uv照明波长将受到cfb衰减的限制。
当暴露在紫外线照射下时，成像镜头和套圈材料不会显示荧光。组织自发荧光信号通常非常低，并且来自材料的任何其他荧光都会将信噪比降低到不可接受的水平。目前，此要求消除了用于注塑，3-d打印，金刚石车削或grin材料的塑料或聚合物。紫外线波长要求也限制了近端成像系统。假设具有合理的紫外线透射率的cfb可用，那么将cfb的表面中继到检测器的系统将需要的显微镜物镜和管形透镜才能在340 nm以下透射。当在更宽的光谱范围内成像时，色差和检测器光谱响应范围可能是其他问题。
在内窥镜达到模拟分辨率时，fov小于预期。差异可能是由于多种原因造成的。可能的原因是cfb的图像圈大小。它被为190 + 20 μm。镜头设计为远心影像空间。此功能可地减小cfb的入射角依赖性，并在整个图像上提供均匀的照明。远心度还意味着70度视场旨在成像到190 μm直径圆。因此，在5mm的工作距离处，预期的ffov为7.22mm（66度）。如果图像圆缩小到170 μm直径，则成像的ffov将为5.72mm（58度），而210 μm图像圆将对应于7.91mm（75度）的ffov。在5mm的工作距离处测得的ffov为6mm，在公差范围内。纤维束图像圆直径的变化将在分辨率上进行权衡。光纤的数量保持恒定，因此较小的像圈将减少光纤的平均芯到芯间距，从而提高分辨率。这与针对建模分辨率的良好测量结果是一致的，并且可以解释在10mm工作距离下优于建模分辨率的性能。镜头的理论性能设计过高，因此，对准良好的镜头系统仍将光纤限制为像圈尺寸为220 μm，对应于5mmwd（80度）下的8.65mmffov。较大的视场将开始被的晶状体的边缘夹住，这可能会导致不希望的杂散光反射。可能导致ffov降低的其他因素是透镜对准和透镜制造公差。
内窥镜的终目标是用作检测卵巢癌和其他可通过小直径管腔（例如胰管或胆管）到达的组织中其他疾病的有效筛选方法。实现该目标是一个多步骤的过程。此处介绍的代内窥镜成功证明了mfi成像可以小型化，从而可以在亚视中提供广域功能成像。800 μm直径包装。下一步是改进设计，以便可以快速可靠地构建坚固的内窥镜，以在有限的人体试验中提供安全的实时成像。第二代系统的光学工程挑战是简化，缩小和自动化近端光学系统。
为了在手术环境中使用，内窥镜需要坚固且可消毒，而近端系统则需要紧凑且便携以便集成到手术车中。以前一直缺乏简单，紧凑的紫外线源，特别是对于短于315 nm的波长。当前原型中的uv波长由内部定制的大型激光器提供。尽管光束质量足以传送紧凑光纤的uv-b和uv-c光源仍然难以实施，但二极管和dpss激光器以及led技术的发展已使紧凑，坚固，低功率的uv-a光源成为可能。一个现实。现在可以构建一个非常紧凑的光源，其波长范围从近紫外线到近红外。一些较新的光源允许足够短的开/关调制，从而可以通过计算机轻松地自动化捕获与每个照明波长的探测器采集同步的图像序列的过程。
近端成像光学系统目前使用具有10位高速fw的改进型显微镜支架。该设计允许快速更换发射滤光片，以使用原型设备优化波长组合，而以实时成像为代价。手术过程中出现的理想图像组合需要妇科医生的进一步发展。一旦确定了理想的滤光带，就可以使用原型系统构建针对实时成像优化的第二代近端成像系统。
例如，图7（d）（猪假色荧光）需要三幅图像，每幅图像都要经过60秒的曝光才能使用窄带（约10 nm fwhm）发射滤镜。先前在实验室进行的体外mfi组织成像研究成功地使用了带宽为35至100 nm的发射滤光片。用市售的高透射率代替干涉滤光片50 +纳米带宽的滤光片将使近端系统的光收集效率提高一个数量级。通过将fw和单色检测器替换为能够同时成像所有波长带的快照多光谱成像相机，可以实现成像速度的另一个数量级增益。购买或构建这样的系统超出了此原型构建的范围。成像速度的优势实际上是双重的。图像采集时间的直接减少是由于在一次曝光中收集了所有光谱信息并消除了滤镜切换的时间延迟。激发光的大安全暴露极限必须仅考虑一次暴露，而不是多次暴露。因此，该技术的成像速度的第二个优点是安全地增加照明强度，以进一步减少足够的光收集所需的曝光时间。同时采集的终优势是消除了连续图像之间的运动伪像。通过将ar涂层添加到远端和近端mfi光学器件，可以进一步提高光收集效率。〜41 ％到10％这三个主要变化以及其他小的优化措施对于在第二代设备中实现实时mfi成像将是必需的。
一些政府监管机构和其他组织，包括非电离辐射防护委员会（icnirp），发布了眼睛和皮肤的辐射暴露限值。这些是对内部组织的进一步研究，它们是的可用指南。375和250 nm的光限制为39,000和7毫焦/ 厘米2，对于靠近内窥镜的组织，功率密度。假设组织在筛选过程中以1 mm的工作距离暴露于紫外线辐射下多1分钟，则平均激光功率的限制是在375 nm处为5.1 mw，在250 nm处为0.001 mw。猪的组织图7（d）是在375 nm激发下以相似的平均激光功率成像的，但工作距离为约10mm 。在更长的工作距离下，获取三张连续图像的估计总曝光量为<2％375 nm处的极限值可以通过实施上述优化进一步降低。满足250 nm激发下的暴露极限将具有挑战性，并且需要优化系统效率。
此处介绍的设备实现了初始的概念验证目标。在第二代实施讨论的变更将允许进行有限的人体试验，以进一步验证和完善该技术。对于具有第三代设备的高风险患者，长期的大型临床试验对于确定常规筛查技术的实际疗效很有必要。
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