2（发酵法）液相色谱分析方法
*2（发酵法）液相色谱分析方法(*2016年第8号)
a.4 *2含量的测定
a.4.1试剂和材料
a.4.1.1*2标准品（七烯甲萘醌，mk-7）。
a.4.1.2异丙醇：分析纯。
a.4.1.3甲醇：色谱纯。
a.4.2仪器和设备
a.4.2.1液相色谱仪。
a.4.2.2紫外光检测器：可变波长。
a.4.2.3数据处理系统：色谱工作站或数据处理机。
a.4.3参考色谱条件
*的色谱柱及典型操作条件如下表a.1，其他能达到同等分离程度的色谱柱和色谱操作条件均可使用。
a.1色谱柱和色谱操作条件
色谱柱 c18(ods)柱，柱长150 mm，内径4.6mm，内装c18填充物，粒径5μm或是相当者
柱温/℃ 50
流动相 甲醇
流速/ ml/min 1.0
检测波长/nm 254
进样量/ μl 10
a.4.4分析步骤
a.4.4.1 试样溶液处理
精密称取试样适量（至0.001 g）于10 ml容量瓶中，加入异丙醇超声30 min，用异丙醇定容至刻度，摇匀，过0.45 μm滤膜，得上样试样。
a.4.4.2 标准品溶液配制
精密称取七烯甲萘醌标准品适量，用异丙醇溶解并定容，配制成浓度为20 μg/ml的标准品溶液。
a.4.4.3 试样测定
用标准品和试样溶液10 µl注入液相色谱仪中测定，以保留时间定性，峰面积外标法定量。
a.4.5结果计算
*2的含量w，单位为微克每克(μg/g)，按式（a.1）计算：
………………………………………………（a.1）
式中：
a1——试样中*2（七烯甲萘醌）对应峰面积；
a2——标准品中*2（七烯甲萘醌）对应峰面积；
c1——进样标准品中*2（七烯甲萘醌）的浓度，单位为微克每毫升（µg/ml）；
v1——供试试样定容体积，单位为毫升（ml）；
m1——试样的质量，单位为克（g）。
试验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的差值不大于算术平均值的10 %。
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a.4.2.1液相色谱仪。
a.4.2.2紫外光检测器：可变波长。
a.4.2.3数据处理系统：色谱工作站或数据处理机。
a.4.3参考色谱条件
*的色谱柱及典型操作条件如下表a.1，其他能达到同等分离程度的色谱柱和色谱操作条件均可使用。
a.1色谱柱和色谱操作条件
色谱柱 c18(ods)柱，柱长150 mm，内径4.6mm，内装c18填充物，粒径5μm或是相当者
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流速/ ml/min 1.0
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a.4.4分析步骤
a.4.4.1 试样溶液处理
精密称取试样适量（至0.001 g）于10 ml容量瓶中，加入异丙醇超声30 min，用异丙醇定容至刻度，摇匀，过0.45 μm滤膜，得上样试样。
a.4.4.2 标准品溶液配制
精密称取七烯甲萘醌标准品适量，用异丙醇溶解并定容，配制成浓度为20 μg/ml的标准品溶液。
a.4.4.3 试样测定
用标准品和试样溶液10 µl注入液相色谱仪中测定，以保留时间定性，峰面积外标法定量。
a.4.5结果计算
*2的含量w，单位为微克每克(μg/g)，按式（a.1）计算：
………………………………………………（a.1）
式中：
a1——试样中*2（七烯甲萘醌）对应峰面积；
a2——标准品中*2（七烯甲萘醌）对应峰面积；
c1——进样标准品中*2（七烯甲萘醌）的浓度，单位为微克每毫升（µg/ml）；
v1——供试试样定容体积，单位为毫升（ml）；
m1——试样的质量，单位为克（g）。
试验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的差值不大于算术平均值的10 %。
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