Flowcytomix中文操作参考步骤
flowcytomix 中文操作参考步骤
以flowcytomix multiplex kit ?——human th1/th2 11plex为例(cat.no. bms810ff)。( human ifn-gamma, il-1-beta, il-2, il-4, il-5, il-6, il-8, il-10, il-12 p70, tnf-alpha 和tnf-beta)
试剂：
1. 微球及缓冲液
1) cytokines capture beads，抗体包被的微球时间长了会有沉淀，用前斡旋混匀3-5秒。
2) setup beads 1瓶 (sb) 。
3) assay buffer 1瓶(ab)(10×，50ml)。
4) reagent dilution buffer (rdb)1瓶 13ml。
2. 抗体及标准试剂
1) 1瓶streptavidin-pe 二抗(200ul)：pe标记的抗*抗体。
2) 11瓶biotin-conjugate 抗体(20×；350ul)，
3) 22瓶standards (c)：每种因子有2瓶，为冻干粉400ng/ml，包含了冻干的人重组蛋白，每个瓶用去离子水稀释准备母液标准品。重悬之后，在2~8℃稳定，12小时内使用。
实验前准备：
1. 准备因子标准品：
1) 打开每瓶冻干粉的炎症因子标准品，加入一定量(瓶身有说明)的去离子水溶解重悬，11种标准品分别取10μl加到90μl的assay buffer中充分混匀，标记上s1(1：20)。
2) 在梯度倍比稀释之前，先使得溶解的s1保持均衡15分钟。只能用枪微混匀，不能vortex及剧烈吸取。
3) 标记用于梯度稀释的流式管s2~s7，标记后每管加入100ul的assay buffer(ab)
4) 梯度稀释：从母液中吸取50ul的稀释液加入标记s2的稀释管中，混匀组分，打掉枪头，然后从s2中再吸取50ul加入s3管中，打掉枪头，再次混匀，再从中吸取50μl加入s4管，混匀，打掉枪头，从s4中再吸取50ul加入下一管。依次进行至s7。
2. 准备因子捕获微球
1) 计算试验管的数目：包括标准品、样品、设定和对照管
例：8个血清样本，7个标准稀释液，1个阴性对照，1个设定管，共17个管。考虑每次可能产生气泡等损失，因此，多算3个管，即20个
标准品管数+血清标本数+3=总管数
2) vortex每一个捕获微球悬液管数秒。
3) 混合微球悬液：
每个试验管加入25ul混合微球悬液，如20次试验管，则v=20×25μl=500μl，每种微球加v的1/20(也就是25μl)标记mixed captured beads，rdb定容至v。
4) 3000g离心5min,小心吸走上清450μl,留50ul。
5) 加入450ul rdb,斡旋混匀5s。混匀的捕获微球现在准备转移到试验管中(每个试验管中加入25ul的混匀微球)
3. 准备biotin-conjugate 抗体和streptavidin-pe
预计每管加50ul。故按照捕获微球量方法进行计算(同上)。
4. 准备实验血清/血浆标本
稀释样本，1:2或1:10或1:100或1:250(根据预实验结果选择)
★实验流程：
1. 准备assay buffer(把10稀释为1×)
2. 按照软件计算结果(如图)准备抗*抗体混合物(biotin-conjugate 抗体)，捕获微球混合物(beads mixture)和标准品混合物(standard mixture)。
3. 吸取25μl稀释后的标准品到s1-7号管中(按照标准品的倍比稀释后的，准备两套，加一管s1)。
4. 向2个空白管中加25μl 1×assay buffer。
5. 向设定管中加25ul的s1，其余管加样品25ul。
6. 向所有管中加25ul beads mixture和50ul biotin-conjugate 抗体,充分混匀，室温避光孵育2h，加1ml 1×assay buffer，200g 离心5min,小心吸弃上清留100ul，重复一次。
7. 加50ul pe-conjugate 抗体 室温避光孵育1h，加1ml 1×assay buffer，200g 离心5min,小心吸弃上清留100ul，重复一次。
8. 每管加500ul 1×assay buffer 混匀，上机检测。(流式分析之前，混匀每个样本3-5秒)。
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1. 微球及缓冲液
1) cytokines capture beads，抗体包被的微球时间长了会有沉淀，用前斡旋混匀3-5秒。
2) setup beads 1瓶 (sb) 。
3) assay buffer 1瓶(ab)(10×，50ml)。
4) reagent dilution buffer (rdb)1瓶 13ml。
2. 抗体及标准试剂
1) 1瓶streptavidin-pe 二抗(200ul)：pe标记的抗*抗体。
2) 11瓶biotin-conjugate 抗体(20×；350ul)，
3) 22瓶standards (c)：每种因子有2瓶，为冻干粉400ng/ml，包含了冻干的人重组蛋白，每个瓶用去离子水稀释准备母液标准品。重悬之后，在2~8℃稳定，12小时内使用。
实验前准备：
1. 准备因子标准品：
1) 打开每瓶冻干粉的炎症因子标准品，加入一定量(瓶身有说明)的去离子水溶解重悬，11种标准品分别取10μl加到90μl的assay buffer中充分混匀，标记上s1(1：20)。
2) 在梯度倍比稀释之前，先使得溶解的s1保持均衡15分钟。只能用枪微混匀，不能vortex及剧烈吸取。
3) 标记用于梯度稀释的流式管s2~s7，标记后每管加入100ul的assay buffer(ab)
4) 梯度稀释：从母液中吸取50ul的稀释液加入标记s2的稀释管中，混匀组分，打掉枪头，然后从s2中再吸取50ul加入s3管中，打掉枪头，再次混匀，再从中吸取50μl加入s4管，混匀，打掉枪头，从s4中再吸取50ul加入下一管。依次进行至s7。
2. 准备因子捕获微球
1) 计算试验管的数目：包括标准品、样品、设定和对照管
例：8个血清样本，7个标准稀释液，1个阴性对照，1个设定管，共17个管。考虑每次可能产生气泡等损失，因此，多算3个管，即20个
标准品管数+血清标本数+3=总管数
2) vortex每一个捕获微球悬液管数秒。
3) 混合微球悬液：
每个试验管加入25ul混合微球悬液，如20次试验管，则v=20×25μl=500μl，每种微球加v的1/20(也就是25μl)标记mixed captured beads，rdb定容至v。
4) 3000g离心5min,小心吸走上清450μl,留50ul。
5) 加入450ul rdb,斡旋混匀5s。混匀的捕获微球现在准备转移到试验管中(每个试验管中加入25ul的混匀微球)
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4. 准备实验血清/血浆标本
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1. 准备assay buffer(把10稀释为1×)
2. 按照软件计算结果(如图)准备抗*抗体混合物(biotin-conjugate 抗体)，捕获微球混合物(beads mixture)和标准品混合物(standard mixture)。
3. 吸取25μl稀释后的标准品到s1-7号管中(按照标准品的倍比稀释后的，准备两套，加一管s1)。
4. 向2个空白管中加25μl 1×assay buffer。
5. 向设定管中加25ul的s1，其余管加样品25ul。
6. 向所有管中加25ul beads mixture和50ul biotin-conjugate 抗体,充分混匀，室温避光孵育2h，加1ml 1×assay buffer，200g 离心5min,小心吸弃上清留100ul，重复一次。
7. 加50ul pe-conjugate 抗体 室温避光孵育1h，加1ml 1×assay buffer，200g 离心5min,小心吸弃上清留100ul，重复一次。
8. 每管加500ul 1×assay buffer 混匀，上机检测。(流式分析之前，混匀每个样本3-5秒)。
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