毛细管区带电泳（CZE）对单克隆抗体的电荷异质性分析
毛细管区带电泳（cze）对单克隆抗体的电荷异质性分析
前言
电荷异质性分析对于单克隆抗体的表征是非常重要的，因为它可提供有关产品的质量和稳定性的重要信息。异质性可源于分子层面的改变，如c-末端赖氨酸修饰、脱酰胺化和翻译后修饰。毛细管等电聚焦（cief）是一种可以根据蛋白各亚型等电点的变化分离电荷异构体的方法。毛细管等电聚焦（cief）需要在涂层毛细管中进行电泳分离，涂层毛细管可以抑制电渗流（eof）并且可以防止蛋白在管壁表面的吸附，但需要较长的分析时间周期和复杂的样品制备。
本文展示了通过使用一个简单的分离缓冲体系和非涂层毛细管，可以在12分钟内对单克隆抗体的电荷异质性进行分析，得到高分辨率和高重现性的分离结果。在本研究中，使用有效长度为20 cm的短毛细管即可获得较高分辨率，若使用有效长度为40 cm的毛细管还可以揭示单克隆抗体的更精细的结构。
实验条件
毛细管区带电泳
分离缓冲液的配制：0.05% hpmc , 380 mm eaca, 1.9 mm teta
400 mm eaca + 2 mm teta（ph =5.7）缓冲液的配制
在含有95 ml去离子水的100 ml烧杯中加入5.25 g的eaca（sigma, cat. no. a-7824）和30 μlteta（三乙烯四胺，sigma, cat. no. 90460）。充分溶解后，用冰醋酸调节ph至5.7±0.05。将上述溶液转移至100 ml容量瓶中，并用去离子水定容。所得溶液用0.2 μm 滤膜过滤。
1% hpmc溶液的配制
将1g hpmc（sigma, cat. no. h-7509）加入到含有100 ml去离子水的烧杯中，室温过夜使其充分溶解。
分离缓冲液的配制
移取400 mm eaca + 2 mm teta（ph = 5.7）缓冲液8.55 ml至 15 ml离心管中，加入1% hpmc溶液450 μl，充分混合。每次使用前新鲜配制。这里准备的分离缓冲液量足够运行9次分离。
毛细管冲洗液
0.1 n hcl 溶液（fluka, part no. 94015）。
样品
单克隆抗体x是一种具有代表性的治疗性单克隆抗体。原液为20 mg/ ml的单抗x，用去离子水稀释至1mg/ml，并用于毛细管等电聚焦（cief）和毛细管区带电泳（cze）的分离。
毛细
管规格：熔融石英，50 μm内径，360 μm外径。用于高分辨率分离方法的毛细管总长度为50 cm，有效长度为40 cm；用于快速分离方法的毛细管总长度为30 cm，有效长度为20 cm。
仪器
本次实验使用的仪器是pa 800 plus生物制药分析系统配备uv或pda检测器。使用uv检测器时，在毛细管区带电泳（cze）实验中配置214 nm的滤光片并且数据采集频率设置为4 hz，而在毛细管等电聚焦（cief）实验中配置280 nm的滤光片。pda检测器则用于重复毛细管区带电泳（cze）实验用于之后和uv/vis的数据进行比较。样品储藏温度和卡盒的温度分别为20 ℃和25 ℃。
毛细管区带电泳（cze）方法
结果与讨论
分别运用毛细管等电聚焦（cief）和毛细管区带电泳（cze）的方法对单克隆抗体x电荷异质性进行了分析。典型单克隆抗体x等电聚焦的分离说明其具有复杂的电荷异构体，等电点范围从pi 6.3到pi 6.91（图1）。在ph = 5.7的缓冲体系下，由于可能存在潜在蛋白溶解度问题1，我们并不能确认使用毛细管区带电泳（cze）分离是否能够对此样品进行有效的分离。然而，实验结果表明，虽然该单克隆抗体是弱酸性的，且其等电点与分离缓冲液的ph值相差不到1个ph单位，但毛细管区带电泳（cze）方法在12分钟内就可以获得*的高分辨的分离（图2）。
图1. 单克隆抗体x的毛细管等电聚焦（cief）电泳图，单克隆抗体的浓度为1 mg/ml
图2. 单克隆抗体x在毛细管区带电泳（cze）条件下的电泳图和积分。电荷异构峰分别归类为碱性峰，主峰和酸性峰。毛细管区带电泳（cze）条件：单克隆抗体x 1 mg/ml；分离缓冲液：0.05% hpmc，380 mm eaca（*），1.9 mm teta；熔融石英毛细管，30 kv分离电压。
结果表明，毛细管区带电泳（cze）的分离方法可以实现高分辨率的分离（图3）。此外，在碱性峰区域的分辨率优于毛细管等电聚焦（cief）。毛细管区带电泳（cze）的一个重要的优势是不仅仅分辨率高，而且分析速度快。得到完整的电荷异质性分离分析，毛细管区带电泳（cze）只需要12分钟而毛细管等电聚焦（cief）则需要23分钟。
实验的重复性是十分重要的，在这里进行了连续多次的毛细管区带电泳（cze）运行来说明其分离重现性（图4）。按照图2的方式对这些数据进行积分（图5），得到碱性峰、主峰和酸性峰群。连续多针运行结果表明毛细管区带电泳（cze）分离具有杰出的重现性，其酸性峰、主峰和碱性峰的校正峰面积rsd小于3%，迁移时间rsd小于0.55%（表1）。
表1. 毛细管区带电泳（cze）分析单克隆抗体x的原始数据。碱性、中性和酸性样品峰的矫正峰面积和迁移时间的重现性
图3. 单克隆抗体x的毛细管等电聚焦（cief）和毛细管区带电泳（cze）分析方法对比
图4. 单克隆抗体x的毛细管区带电泳（cze）分离。9针连续的分离均使用uv检测器。单克隆抗体x的浓度为1 mg/ml；缓冲液：0.05% hpmc，380 mm eaca，1.9 mm teta；熔融石英毛细管，30 kv分离电压
图5. 分析单克隆抗体x 的32 karat软件积分参数
毛细管区带电泳（cze）还具有很大的灵活性，不同检测器的类型都能提供相同的性能。使用毛细管区带电泳（cze）的方法无论配置二极管阵列检测器或是紫外检测器对单抗x进行分离都可以获得相同的分辨率。此外，使用这两种检测器还可得到相同的组分面积百分比（图6）。
若希望获得更高的分辨率，可通过增加毛细管的有效长度，能得到比快速分离的方法更精细的分离。如图7所示，使用有效长度为40 cm的毛细管对单克隆抗体x进行分离，尽管总分离时间有所增加，但高分辨率有了明显的提高。
更高的分辨率有利于对单克隆抗体x的降解状态（如暴露在60 ℃48个小时）进行分析。然而，只有增加毛细管的有效长度，才有可能看到因为热不稳定性形成的酸性峰和碱性峰的精细结构。
图6. 使用uv和pda检测器进行毛细管区带电泳（cze）分离的对比。uv检测器（红色），pda检测器（黑色）。分离条件均如图1所述
图7. 不同毛细管有效长度的结果对比。毛细管区带电泳（cze）分离条件如前所述。40 cm有效长度（下图），20 cm有效长度（插图）
图8. 单克隆抗体x在高温下（60℃）暴露5天降解后的分析。分别使用40 cm毛细管有效长度（下图）和20 cm毛细管有效长度（插图）进行毛细管区带电泳（cze）的分离
结论
使用毛细管区带电泳（cze）和毛细管等电聚焦（cief）的方法都可以很容易的检测蛋白质电荷异质性。毛细管等电聚焦（cief）通常用于获得电荷异质性和等电点的信息，而本文介绍的毛细管区带电泳（cze）方法具有对典型单克隆抗体快速及高重现性分离的能力。该毛细管区带电泳（cze）方法可以通过增加毛细管的有效长度进行提高峰分辨率的优化。毛细管区带电泳（cze）分离的性能不受检测器的影响，毛细管区带电泳（cze）可以在碱性峰、主峰和酸性峰分离中表现出很好的重现性。基于上述优势可见，毛细管区带电泳（cze）是一种可以替代毛细管等电聚焦（cief）的快速分析方法，在保证分离效果和重现性的同时，为高通量分析提供了可能。
references
1. yan he, colleen isele, weiying hou, margaret ruesch. 2011. rapid analysis of charge variants of monoclonal antibodies with capillary zone electrophoresis in dynamically coated fused-silica capillary. journal of separation science, vol. 34: pages 548-555.
2. ingrid d. cruzado-park, scott mack and chitra k. ratnayake, a robust cief method: intermediate precision for the ph 5-7 range, pn a-12015
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