流式细胞术——区分活细胞和死细胞的方法
流式细胞分析时，样本细胞中一般都含有一定量的死细胞，通过一定的方法可以减少样本中死细胞的比例，但是*去除样本中的死细胞几乎是不可能的。但流式分析的目标为活细胞，因此流式分析时将死细胞当作活细胞来分析，会严重影响流式分析的结果，通常可以选择荧光染料来标记区分死活细胞的方法，下面介绍一些流式分析时区分死细胞和活细胞的简单方法。
（1）对角线死细胞
通常都悉知对角线可以区分死细胞，那么为什么死细胞会聚集在对角线上呢？原因是死细胞也可以产生非特异性荧光，而且死细胞产生的非特异性的荧光要明显强于活细胞，甚至强于荧光素产生的荧光信号。非特异性荧光的波长是没有选择性的，不局限于某一波长范围，所以一般所有常用的荧光信号通道都能够接收到死细胞产生的非特异性荧光信号，而且该信号在所有波长范围的荧光强度相差不多，各个荧光通道接收到的荧光强度都是处于同一个等级的。因此，在散点图上死细胞是位于对角线上的，而且不同的死细胞，其非特异性荧光的强度不同，并且差异性强度很大，所以从整体来看，死细胞的非特异性荧光强度呈现从低到高的连续性分布，表现在散点图上死细胞刚好处于对角线上，如图1-a所示呈线性，与活细胞群体的圆形分布有明显的区别，因此我们可以根据死细胞这一特性区分活细胞和死细胞。
图1：对角线死细胞流式图（来源于《流式细胞术》）
虽然死细胞位于散点图的对角线上，但是对角线上的细胞确不一定是死细胞，因为双阳性细胞如果在x轴和y轴的荧光信号相似时，也可以位于对角线上。所以，散点图对角线上的细胞可能是死细胞，也可能是双阳性细胞。如图1-b所示，样本细胞为正常小鼠脾脏细胞，标记fitc-抗cd3抗体和pe-抗cd4抗体，fitc和pe双阳性的cd4t细胞和死细胞混在一起，无法区分。但是死细胞和双阳性细胞的形状是不一样的，死细胞呈现连续的线型分布，而双阳性细胞群呈现圆形的群体分布，因此，可以从对角线上的细胞群体的形状大致判断细胞的性质。虽然不能根据荧光强度的强弱来区分该荧光信号是来自于死细胞的非特异性荧光还是来自荧光素产生的荧光，但是可以利用在散点图上死细胞位于对角线的特点来区分死细胞和阳性活细胞。如图1-c所示，x轴表示fitc通道（样本细胞标记有fitc-抗cd3抗体），y轴表示apc通道（闲置通道），借用该散点图可以明确区分图1-b中无法区分的死细胞和双阳性细胞。此时只需要将排除了死细胞后的cd3t细胞设门，将门内的细胞显示于新的fitc-pe散点图中，如图1-d，此时该散点图内的细胞都是活细胞，因为样本细胞同时标记有pe-抗cd4抗体，所以图中的细胞明显分为两群，双阳性的是cd4t细胞，单阳性的是cd8t细胞。
（2）pe-cy5通道非标记阳性细胞
pe-cy5通道（通常是fl3，接收的荧光波长范围大致为655-685nm）有时可用于识别死细胞，但首先该通道必须是闲置的通道，及样本细胞中没有标记该通道代表的荧光素（pe-cy5、percp等）偶联抗体。选择pe-cy5-ssc散点图，一般可看到不成群的pe-cy5阳性细胞，这些阳性细胞的ssc值也是散在分布的，这些散在的pe-cy5通道非标记阳性细胞，即图2-a中的红色部分，将这部分细胞设门显示于fitc-pe散点图中，如图2-b所示，这部分pe-cy5通道非标记阳性细胞基本都位于对角线部分，而对角线细胞一般为死细胞，所以散在的pe-cy5通道非标记阳性细胞一般就是死细胞。
图2pe-cy5通道非标记的阳性细胞（来源于《流式细胞术》）
因此利用pe-cy5通道非标记阳性细胞区分活细胞和死细胞时，可以先在fsc-ssc图中选择目标所在的细胞群，将其设门，然后将门内的细胞显示于pe-cy5-ssc散点图中，排除pe-cy5通道非标记阳性细胞代表的死细胞，将pe-cy5阴性细胞设门，然后将门内的细胞显示于新的流式图内分析，这是该流式图内的细胞都是活细胞，分析或者分选时就可以尽量排除死细胞的干扰了。
以上两种排除死细胞的方法只是一种经验的方法，一般在实验要求不高或者预实验时使用，流式分析时可以借鉴这两种方法区分死细胞和活细胞，但是不能将这两种方法作为区分死细胞和活细胞的标准方法，使用死活细胞染料，例如常见的7-aad，pi和zombiedyes系列等才是标记死活细胞的正确方法。
(3)7-aad、pi标记死细胞
7-aad（7氨基放线菌素d）与pi（碘化丙啶）是经典的核酸标记染料，在流式细胞术中能够用于标记死细胞，以排除死细胞对实验结果的干扰。7-aad的荧光信号被percp通道接收，所以7-aad不能与percp或pe-cy5偶联的抗体共同标记样本细胞。但其发射的荧光波长基本不与pe发射的荧光重叠，因此可以与和pe共同标记样本细胞。而pi染料被激发后发射的荧光波谱范围很大，常规fl2、fl3都能接收到其荧光信号，并且与pe、percp、pe/cy5荧光素发射的荧光波长有很大程度的重叠，因此pi染料不宜与这些染料共标记。
7-aad、percp、pe、pi、pe/cy5发射光谱：
（4）zombiedyes标记死细胞
当流式检测只分析细胞表面抗原分子，且不对样本固定时，7-aad和pi是比较理想和经典的方法。但是如果需要分析细胞内的分子，如检测胞内细胞因子、胞内活化的激酶和核内分子等需要固定样本细胞，在胞膜上打孔，使荧光素偶联抗体能够通过细胞膜进入细胞内，与相应目标分子结合，这时7-aad与pi就无法鉴别死细胞和活细胞了。
图为：体外培养一天的c57bl/6小鼠脾细胞做annexinv/pi染色的流式数据。其中，左边为未经固定处理的细胞上机检测结果；右边为经过70%etoh,1.5%pfa固定处理的细胞上机检测结果。
图为：体外培养一天的c57bl/6小鼠脾细胞做annexinv/7-aad染色的流式数据。其中，左边为未经固定处理的细胞上机检测结果；右边为经过70%etoh,1.5%pfa固定处理的细胞上机检测结果。
zombiedyes有别于pi和7-aad等dna染料，它是一种可用于需固定细胞实验的染料，通过与细胞上蛋白质的氨基结合来实现。因活细胞可排除染料，所以仅细胞膜被着色；而死细胞的细胞膜及细胞质均被着色，继而根据荧光信号的强弱来区分死/活细胞。而且zombiedyes可选择性多，可以由不同的激发光激发，便于灵活选择。
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zombiedyes的发射光谱：
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（1）对角线死细胞
通常都悉知对角线可以区分死细胞，那么为什么死细胞会聚集在对角线上呢？原因是死细胞也可以产生非特异性荧光，而且死细胞产生的非特异性的荧光要明显强于活细胞，甚至强于荧光素产生的荧光信号。非特异性荧光的波长是没有选择性的，不局限于某一波长范围，所以一般所有常用的荧光信号通道都能够接收到死细胞产生的非特异性荧光信号，而且该信号在所有波长范围的荧光强度相差不多，各个荧光通道接收到的荧光强度都是处于同一个等级的。因此，在散点图上死细胞是位于对角线上的，而且不同的死细胞，其非特异性荧光的强度不同，并且差异性强度很大，所以从整体来看，死细胞的非特异性荧光强度呈现从低到高的连续性分布，表现在散点图上死细胞刚好处于对角线上，如图1-a所示呈线性，与活细胞群体的圆形分布有明显的区别，因此我们可以根据死细胞这一特性区分活细胞和死细胞。
图1：对角线死细胞流式图（来源于《流式细胞术》）
虽然死细胞位于散点图的对角线上，但是对角线上的细胞确不一定是死细胞，因为双阳性细胞如果在x轴和y轴的荧光信号相似时，也可以位于对角线上。所以，散点图对角线上的细胞可能是死细胞，也可能是双阳性细胞。如图1-b所示，样本细胞为正常小鼠脾脏细胞，标记fitc-抗cd3抗体和pe-抗cd4抗体，fitc和pe双阳性的cd4t细胞和死细胞混在一起，无法区分。但是死细胞和双阳性细胞的形状是不一样的，死细胞呈现连续的线型分布，而双阳性细胞群呈现圆形的群体分布，因此，可以从对角线上的细胞群体的形状大致判断细胞的性质。虽然不能根据荧光强度的强弱来区分该荧光信号是来自于死细胞的非特异性荧光还是来自荧光素产生的荧光，但是可以利用在散点图上死细胞位于对角线的特点来区分死细胞和阳性活细胞。如图1-c所示，x轴表示fitc通道（样本细胞标记有fitc-抗cd3抗体），y轴表示apc通道（闲置通道），借用该散点图可以明确区分图1-b中无法区分的死细胞和双阳性细胞。此时只需要将排除了死细胞后的cd3t细胞设门，将门内的细胞显示于新的fitc-pe散点图中，如图1-d，此时该散点图内的细胞都是活细胞，因为样本细胞同时标记有pe-抗cd4抗体，所以图中的细胞明显分为两群，双阳性的是cd4t细胞，单阳性的是cd8t细胞。
（2）pe-cy5通道非标记阳性细胞
pe-cy5通道（通常是fl3，接收的荧光波长范围大致为655-685nm）有时可用于识别死细胞，但首先该通道必须是闲置的通道，及样本细胞中没有标记该通道代表的荧光素（pe-cy5、percp等）偶联抗体。选择pe-cy5-ssc散点图，一般可看到不成群的pe-cy5阳性细胞，这些阳性细胞的ssc值也是散在分布的，这些散在的pe-cy5通道非标记阳性细胞，即图2-a中的红色部分，将这部分细胞设门显示于fitc-pe散点图中，如图2-b所示，这部分pe-cy5通道非标记阳性细胞基本都位于对角线部分，而对角线细胞一般为死细胞，所以散在的pe-cy5通道非标记阳性细胞一般就是死细胞。
图2pe-cy5通道非标记的阳性细胞（来源于《流式细胞术》）
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