液相筛选相关问题
一．缓冲液的选择
缓冲液的选择不仅要考虑目标物的稳定性，还要考虑与微环境结合的实际应用情况，尽量减少非特异性结合。使用无关蛋白质、非离子剂除垢剂和生理盐浓度有利于降低背景。同时还有一些其他条件，如有些靶标可能需要在缓冲液中添加二价阳离子或其他辅助因子，蛋白质辅助因子可以与靶标共同固定，也可以添加到分选缓冲液中，甚至可以作为捕获靶标的一种方法。
二．选择压的考虑
常见的选择性压力考虑因素包括：目标分子的浓度、结合时间和洗涤强度。提高选择压力的其他技术包括使用变性剂（如酸、尿素和胍）、有机溶剂、提高温度或增加洗涤缓冲液中竞争配体或目标物的浓度。一轮筛选尤为重要，其目的是从构建的文库中捕获尽可能多的阳性克隆，同时去除非特异性克隆，筛选时应使用多孔后涂层靶标或大量可溶性靶标，以确保捕获大量结合噬菌体，从而保持文库的多样性。
三．如何减少抗原标签和载体材料对筛选效率的影响
在筛选过程中，可能会筛选出针对抗原上所有物质的共轭物，如抗原标签、融合蛋白和载体材料。为了克服这个问题，通常可以使用针对非目标的负筛选来限制针对目标抗原以外的抗体的富集。例如，在使用链霉亲和素磁珠筛选生物素化蛋白质之前，可将文库与链霉亲和素磁珠和生物素化非目标蛋白质预结合，以减少这类不需要的结合物的比例。
四．如何去除复杂的抗原混合物
对于未知或复杂的目标分子，如全细胞或不纯蛋白质，可进行严格的负向筛选。例如，在事先不了解目标蛋白，但非目标蛋白是已知的情况下对全细胞进行负向筛选。在负向筛选过程中，噬菌体展示文库首先与非目标抗原对应的重组蛋白孵育。然后将未结合的噬菌体转移到目标抗原上进行筛选。
五．固相与液化抗原筛选法的选择
当抗体库容量大、目标抗体预期拷贝数高或亲和力高、抗原来源丰富时，固化抗原筛选法可靠易用，有利于获得高亲和力、高特异性的抗体。当预计目标抗体较难获得或固化抗原筛选不成功时，可采用生物素化抗原液相筛选法。当筛选的目的是选择高亲和力抗体时，液相筛选法具有明显的优势，尤其是解离率筛选更为高效、快速和可重复，是一种较为理想的手段。
六．文库筛选的方法选择
在一种情况下，如果受体的结构特性已知，并且可以方便地获得受体的线性中和区或多肽片段，那么就可以使用经典筛选策略或高通量筛选。这种策略简单易行，可以筛选出具有高亲和力的抗体，但有可能抗体与天然受体没有任何结合活性。第二种情况是，如果受体的结构特性已知，但没有纯化的蛋白质，则可采用全细胞优化筛选策略或高通量筛选。第三种情况是受体未知，使用适当的阴性细胞来屏蔽共有抗原，然后筛选靶细胞以获得特异性抗体。
七．抗原的包被方式
直接包被与间接包被示意图
包被形式
直接包被
间接包被
包被方法
抗原通过物理吸附直接固定在固相介质表面，蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合，主要靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用，因此疏水氨基酸丰富的区域更容易吸附。
利用固相载体表面的捕获分子来固定抗原。（1）利用链霉亲和素和生物素之间的强共价反应，使抗原间接且稳定地附着在固相载体表面。生物素化有两种不同的策略：定点生物素化和随机生物素化。定点生物素化可利用avi tag实现体内/体外生物素化。（2）利用不同的肽标签和标记特异性捕获分子来实现抗原的间接固定。（3）对于小分子抗原如多肽，可将小分子与载体蛋白如klh，bsa，ova等偶联，用于抗原的呈递，让小分子充分的暴露。其次也可以将小分子与fc，gst，mbp融合表达，然后固定于介质表面
八．结合筛选法的使用
在噬菌体抗体库的筛选过程中，会存在一些非特异性结合，如果一直使用单一筛选方法，这些非特异结合的噬菌体也同样被解离和扩增，从而被保留下来。采用几种淘选方法结合使用，如固相和液相结合的轮换淘洗法，可以有效地避免一些非特异性吸附。
九．解离条件的优化
当结合的噬菌体抗体被解离下以后，只显示中或低亲和力，影响特异性抗体的富集和筛选，需要对解离过程进行了优化。
泰克生物建立了一个完善的、成熟的噬菌体抗体展示技术平台。基于噬菌体展示技术平台，泰克生物可以提供包括抗原设计、羊驼免疫、文库构建与筛选（固/液筛选）、活性功能验证等主要实验环节，并为科学家提供高特异性和高亲和力的驼科动物vhh抗体。
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缓冲液的选择不仅要考虑目标物的稳定性，还要考虑与微环境结合的实际应用情况，尽量减少非特异性结合。使用无关蛋白质、非离子剂除垢剂和生理盐浓度有利于降低背景。同时还有一些其他条件，如有些靶标可能需要在缓冲液中添加二价阳离子或其他辅助因子，蛋白质辅助因子可以与靶标共同固定，也可以添加到分选缓冲液中，甚至可以作为捕获靶标的一种方法。
二．选择压的考虑
常见的选择性压力考虑因素包括：目标分子的浓度、结合时间和洗涤强度。提高选择压力的其他技术包括使用变性剂（如酸、尿素和胍）、有机溶剂、提高温度或增加洗涤缓冲液中竞争配体或目标物的浓度。一轮筛选尤为重要，其目的是从构建的文库中捕获尽可能多的阳性克隆，同时去除非特异性克隆，筛选时应使用多孔后涂层靶标或大量可溶性靶标，以确保捕获大量结合噬菌体，从而保持文库的多样性。
三．如何减少抗原标签和载体材料对筛选效率的影响
在筛选过程中，可能会筛选出针对抗原上所有物质的共轭物，如抗原标签、融合蛋白和载体材料。为了克服这个问题，通常可以使用针对非目标的负筛选来限制针对目标抗原以外的抗体的富集。例如，在使用链霉亲和素磁珠筛选生物素化蛋白质之前，可将文库与链霉亲和素磁珠和生物素化非目标蛋白质预结合，以减少这类不需要的结合物的比例。
四．如何去除复杂的抗原混合物
对于未知或复杂的目标分子，如全细胞或不纯蛋白质，可进行严格的负向筛选。例如，在事先不了解目标蛋白，但非目标蛋白是已知的情况下对全细胞进行负向筛选。在负向筛选过程中，噬菌体展示文库首先与非目标抗原对应的重组蛋白孵育。然后将未结合的噬菌体转移到目标抗原上进行筛选。
五．固相与液化抗原筛选法的选择
当抗体库容量大、目标抗体预期拷贝数高或亲和力高、抗原来源丰富时，固化抗原筛选法可靠易用，有利于获得高亲和力、高特异性的抗体。当预计目标抗体较难获得或固化抗原筛选不成功时，可采用生物素化抗原液相筛选法。当筛选的目的是选择高亲和力抗体时，液相筛选法具有明显的优势，尤其是解离率筛选更为高效、快速和可重复，是一种较为理想的手段。
六．文库筛选的方法选择
在一种情况下，如果受体的结构特性已知，并且可以方便地获得受体的线性中和区或多肽片段，那么就可以使用经典筛选策略或高通量筛选。这种策略简单易行，可以筛选出具有高亲和力的抗体，但有可能抗体与天然受体没有任何结合活性。第二种情况是，如果受体的结构特性已知，但没有纯化的蛋白质，则可采用全细胞优化筛选策略或高通量筛选。第三种情况是受体未知，使用适当的阴性细胞来屏蔽共有抗原，然后筛选靶细胞以获得特异性抗体。
七．抗原的包被方式
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直接包被
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包被方法
抗原通过物理吸附直接固定在固相介质表面，蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合，主要靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用，因此疏水氨基酸丰富的区域更容易吸附。
利用固相载体表面的捕获分子来固定抗原。（1）利用链霉亲和素和生物素之间的强共价反应，使抗原间接且稳定地附着在固相载体表面。生物素化有两种不同的策略：定点生物素化和随机生物素化。定点生物素化可利用avi tag实现体内/体外生物素化。（2）利用不同的肽标签和标记特异性捕获分子来实现抗原的间接固定。（3）对于小分子抗原如多肽，可将小分子与载体蛋白如klh，bsa，ova等偶联，用于抗原的呈递，让小分子充分的暴露。其次也可以将小分子与fc，gst，mbp融合表达，然后固定于介质表面
八．结合筛选法的使用
在噬菌体抗体库的筛选过程中，会存在一些非特异性结合，如果一直使用单一筛选方法，这些非特异结合的噬菌体也同样被解离和扩增，从而被保留下来。采用几种淘选方法结合使用，如固相和液相结合的轮换淘洗法，可以有效地避免一些非特异性吸附。
九．解离条件的优化
当结合的噬菌体抗体被解离下以后，只显示中或低亲和力，影响特异性抗体的富集和筛选，需要对解离过程进行了优化。
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