细胞学堂 | 培养B16系列细胞必看知识点
b16系列细胞属于小鼠黑色素瘤细胞系，是源自c57小鼠的一种皮肤癌细胞，常用于肿瘤生物学研究。
本期细胞学堂为大家整理了b16系列细胞的培养方法与注意事项，b16细胞黑色素的形成原因及解决方法，帮助您快速上手开展实验。
01
b16系列细胞培养方法
培养条件
rpmi-1640(pm150110)＋10%fbs(164210-50)＋1%p/s(pb180120)；
生长特性
贴壁生长，生长迅速，能产生黑色素；
传代方式
0.25%含edta的胰蛋白酶消化2-3min，推荐传代比例1:3-1:4；
冻存
推荐冻存密度1-5×106cell/ml。
注意事项
（1）细胞生长速度快，培养密度不宜过高，需要及时传代和换液，细胞密度过高，会导致细胞状态变差，死亡；
（2）细胞内含黑色素，在细胞会产生黑色素，遇到培养基颜色变深，消化下来的细胞离心后，沉淀为黑褐色或者是灰黑色，此为正常现象。
复苏时细胞沉淀颜色:“灰黑色”（1640培养基）
细胞产黑色素导致培养基变色（1640培养基）
细胞产黑色素导致培养基变色（dmem培养基）
02
黑色素形成原因
该细胞在体外培养有两种培养条件：快速分裂增殖和分化成熟，培养基条件不同可改变该细胞的生长状态，使用rpmi-1640培养基可使其快速增殖，而使用dmem培养基能诱导细胞分化成熟并合成黑色素。建议正常扩增冻存请使用rpmi-1640培养基，若需要进行分泌黑色素等后续相关实验，可以在扩增冻存细胞后更换为dmem培养来满足实验设计。
需要注意的是，b16细胞对培养基条件较为敏感，同样是dmem或rpmi-1640培养基，不同型号、不同厂家的产品，其具体成分的少许差异都有可能改变b16系列细胞的生长状态。在实验时应慎重选择培养基，培养时最好是保持和购买细胞的厂家同一型号的培养基，以保证细胞的性状稳定。
更换培养条件，比如由rpmi-1640更换成dmem会导致黑色素大量形成，细胞培养基变黑，但若稳定培养时未更换培养基，出现培养基突然变黑的情况，有可能是以下几个原因引起的：
1
细胞死亡
如果细胞在培养过程中出现大量细胞死亡，细胞的代谢产物和细胞碎片可能会导致培养基变黑。这可能是由于细胞因状态变差、污染或其他因素引起的。
解决方法：
观察细胞状态，确保细胞的生长条件和培养基正确。如果发现细胞死亡过多，需要重新复苏细胞。
2
细胞污染
如果培养基中出现污染（细菌、真菌、支原体、黑胶虫等），这些微生物的生长和代谢产物可能导致培养基变黑。
解决方法：
排查污染源，检查培养环境，使用的试剂、耗材，注意无菌操作。如果遇到污染情况，应立即更换培养基，进行无菌处理并消除污染源。
03
客户b16-f10细胞实验经验分享
(以下为客户实战经验分享，仅做参考)
01
为了保证b16-f10细胞的活性，通常在传代时尽可能控制胰酶的温度及消化时间，关注b16-f10细胞的消化状态（显微镜下看到细胞明显分离变圆，侧立培养瓶细胞可以滑落时可终止消化）。消化过度导致b16-f10细胞损伤、活性下降。尤其是在进行黑色素合成、分泌和酪氨酸酶活性等相关实验时，更需注意胰酶的消化时间，细胞的消化状态。
02
使用光线对b16-f10细胞进行辐照处理时，有两点值得关注的地方：
（1）光照时须打开培养皿盖，以确保光线照射在b16-f10细胞上，而非被培养皿盖折射与吸收；
（2）辐照前，需要将培养基换成无酚红的rpmi-1640完-全培养基。避免酚红对光线的吸收作用，影响试验结果。
04
b16系列细胞的常见应用
1
黑色素瘤生物学研究
b16细胞系可以用于黑色素瘤的发生、发展和转移机制的研究。通过模拟黑色素瘤细胞在体内的行为，探索细胞增殖、迁移、侵袭、转移等过程。
2
肿瘤药物筛选
b16细胞在体外培养中可以用于筛选和评估抗黑色素瘤药物的疗效。通过将药物添加到培养基中，研究药物对细胞增殖、凋亡、侵袭、转移等生物学行为的影响，以评估其抗肿瘤活性。
3
免疫治疗研究
b16细胞可以用作免疫治疗研究的模型。例如，可以将免疫刺激剂或免疫检查点抑制剂添加到培养基中，研究它们对细胞免疫应答和肿瘤生长的影响，以评估其在黑色素瘤治疗中的潜力。
4
黑色素瘤转移研究
b16细胞的转移能力是其研究的重要方面。可以通过将细胞注射到小鼠的血液循环或特定的器官中，研究黑色素瘤细胞的迁移和转移机制，以及针对转移的治疗策略。
5
细胞信号传导研究
b16细胞可以用于研究细胞信号传导通路在黑色素瘤发生和发展中的作用。例如，可以通过转染或抑制特定的信号分子或途径，研究其对细胞增殖、凋亡、侵袭等生物学行为的影响。
注意：
b16系列细胞虽然在黑色素瘤研究中被广泛使用，但其在体外培养中仍然存在一些局限性，如与体内环境的差异、细胞株的异质性等。因此，在研究中需要综合使用其他模型和方法，以更好地模拟和了解黑色素瘤的生物学特性。
●参考文献●
[1]bae, j. s., han, m., yao, c.,et al. chaetocin inhibits ibmx-induced melanogenesis in b16f10 mouse melanoma cells through activation of erk. chemico-biological interactions,2016,245, 66–71.
[2]陈金妹,林进妹,黄家福等.培养基诱导b16细胞黑色素合成及机理研究[j].闽南师范大学学报(自然科学版),2016,29(2):87-97.doi:10.16007/j。cnki.issn2095-7122.2016.02.014.
[3]costantino, v. v., lobos-gonzalez, l., ibañez, j.,et al.dehydroleucodine inhibits tumor growth in a preclinical melanoma model by inducing cell cycle arrest, senescence and apoptosis. cancer letters,2016,372(1),10–23.
[4]chen, j. h., chang, j. l., chen, p. r.,et al. inhibition of peroxisome proliferator-activated receptor gamma prevents the melanogenesis in murine b16/f10 melanoma cells. biomed research international, 2014, 695797.
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本期细胞学堂为大家整理了b16系列细胞的培养方法与注意事项，b16细胞黑色素的形成原因及解决方法，帮助您快速上手开展实验。
01
b16系列细胞培养方法
培养条件
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生长特性
贴壁生长，生长迅速，能产生黑色素；
传代方式
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冻存
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（1）细胞生长速度快，培养密度不宜过高，需要及时传代和换液，细胞密度过高，会导致细胞状态变差，死亡；
（2）细胞内含黑色素，在细胞会产生黑色素，遇到培养基颜色变深，消化下来的细胞离心后，沉淀为黑褐色或者是灰黑色，此为正常现象。
复苏时细胞沉淀颜色:“灰黑色”（1640培养基）
细胞产黑色素导致培养基变色（1640培养基）
细胞产黑色素导致培养基变色（dmem培养基）
02
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该细胞在体外培养有两种培养条件：快速分裂增殖和分化成熟，培养基条件不同可改变该细胞的生长状态，使用rpmi-1640培养基可使其快速增殖，而使用dmem培养基能诱导细胞分化成熟并合成黑色素。建议正常扩增冻存请使用rpmi-1640培养基，若需要进行分泌黑色素等后续相关实验，可以在扩增冻存细胞后更换为dmem培养来满足实验设计。
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1
细胞死亡
如果细胞在培养过程中出现大量细胞死亡，细胞的代谢产物和细胞碎片可能会导致培养基变黑。这可能是由于细胞因状态变差、污染或其他因素引起的。
解决方法：
观察细胞状态，确保细胞的生长条件和培养基正确。如果发现细胞死亡过多，需要重新复苏细胞。
2
细胞污染
如果培养基中出现污染（细菌、真菌、支原体、黑胶虫等），这些微生物的生长和代谢产物可能导致培养基变黑。
解决方法：
排查污染源，检查培养环境，使用的试剂、耗材，注意无菌操作。如果遇到污染情况，应立即更换培养基，进行无菌处理并消除污染源。
03
客户b16-f10细胞实验经验分享
(以下为客户实战经验分享，仅做参考)
01
为了保证b16-f10细胞的活性，通常在传代时尽可能控制胰酶的温度及消化时间，关注b16-f10细胞的消化状态（显微镜下看到细胞明显分离变圆，侧立培养瓶细胞可以滑落时可终止消化）。消化过度导致b16-f10细胞损伤、活性下降。尤其是在进行黑色素合成、分泌和酪氨酸酶活性等相关实验时，更需注意胰酶的消化时间，细胞的消化状态。
02
使用光线对b16-f10细胞进行辐照处理时，有两点值得关注的地方：
（1）光照时须打开培养皿盖，以确保光线照射在b16-f10细胞上，而非被培养皿盖折射与吸收；
（2）辐照前，需要将培养基换成无酚红的rpmi-1640完-全培养基。避免酚红对光线的吸收作用，影响试验结果。
04
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1
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2
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3
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4
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5
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注意：
b16系列细胞虽然在黑色素瘤研究中被广泛使用，但其在体外培养中仍然存在一些局限性，如与体内环境的差异、细胞株的异质性等。因此，在研究中需要综合使用其他模型和方法，以更好地模拟和了解黑色素瘤的生物学特性。
●参考文献●
[1]bae, j. s., han, m., yao, c.,et al. chaetocin inhibits ibmx-induced melanogenesis in b16f10 mouse melanoma cells through activation of erk. chemico-biological interactions,2016,245, 66–71.
[2]陈金妹,林进妹,黄家福等.培养基诱导b16细胞黑色素合成及机理研究[j].闽南师范大学学报(自然科学版),2016,29(2):87-97.doi:10.16007/j。cnki.issn2095-7122.2016.02.014.
[3]costantino, v. v., lobos-gonzalez, l., ibañez, j.,et al.dehydroleucodine inhibits tumor growth in a preclinical melanoma model by inducing cell cycle arrest, senescence and apoptosis. cancer letters,2016,372(1),10–23.
[4]chen, j. h., chang, j. l., chen, p. r.,et al. inhibition of peroxisome proliferator-activated receptor gamma prevents the melanogenesis in murine b16/f10 melanoma cells. biomed research international, 2014, 695797.
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