细胞多聚ADP核糖聚合酶-1（PARP-1）活性比色法定量检测试剂盒
多聚adp核糖聚合酶-1（poly (adp-ribose) polymerase；parp；ec 2.4.2.30）是一种锌依赖性核酶，广泛存在于真核细胞中。parp家属由18个成员，其中6个已经被证实，包括parp-1（占90％）、parp-2、parp-3、parp-4（vparp）、parp-5a/5b（tankyrase）等。parp蛋白由4个结构域构成：dna结合、切离、自修饰（automodification）、催化等结构域。其功能在于特异性地识别dna损伤产生的单链或双链dna断裂，并与之结合而激活，催化将腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；nad）转化成nicotinamide）和多聚adp核糖分枝聚合体（branched polymers of various poly (adp-ribose)）的反应，由此引导各种dna修复蛋白聚集到损伤部位，实施修复，同时调节染色质结构形成（chromatin structure formation）、细胞分化、繁殖、发育、凋亡、基因表达等，以及对于心脑缺血的反应和肿瘤恶变的作用。抑制parp活性，可以防止心衰、中风、败血症等引起的组织损害。其中parp-1由1014氨基酸残基组成，分子量113kd，是细胞atp/nad细胞凋亡系统的主要调节因子。基于人工合成底物adp核糖对硝基（adp-ribose-p-nitrophenol），在损伤的dna存在的前提下，受到多聚adp核糖聚合酶-1的作用，释放出显色产物对硝基（p-nitrophenol），通过分光光度仪检测吸光读数的变化（405nm波长），来定量分析多聚adp核糖聚合酶-1的活性。其反应系统为：
产品内容
清理液（reagent a） 毫升
裂解液（reagent b） 毫升
缓冲液（reagent c） 毫升
反应液（reagent d） 微升
底物液（reagent e） 微升
阴性液（reagent f） 微升
产品说明书 1份
保存方式
保存裂解液（reagent b）、反应液（reagent d）和底物液（reagent e）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；底物液（reagent e）避免光照；有效保证6月
用户自备
1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器
15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器
细胞刮脱棒：用于脱离贴壁细胞
（微型）台式离心机：用于样品制备
比色皿或酶标板：用于比色的容器
分光光度仪或酶标仪：用于比色分析
实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的裂解液（reagent b）置入冰槽里融化。然后进行下列操作。
一、样品准备（总蛋白制备）
1．准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 x 106细胞）
2．小心加入xx毫升清理液（reagent a），覆盖生长表面
3．小心抽去清理液
4．使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用消化）
5．加入xx毫升清理液（reagent a），混匀细胞
6．移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
8．小心抽去上清液
9．加入xx微升裂解液（reagent b），充分混匀
10．转移到预冷的1.5毫升离心管
11．强力涡旋震荡15秒
12．置于冰槽里孵育30分钟
13．放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000rpm，例如eppendorf 5415）
14．小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
15．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）
16．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、测定准备
1．开启并设定好分光光度仪（温度为25℃）：波长405nm，并置零
2．从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；底物液（reagent e）避免光照；缓冲液（reagent c）室温下预热
三、背景对照测定
1．移取xx微升缓冲液（reagent c）到新的比色皿
2．加入xx微升反应液（reagent d）
3．加入xx微升底物液（reagent e）
4．加入xx微升阴性液（reagent f）
5．上下倾倒数次，混匀
6．在25℃温度下孵育2小时
7．即刻放进分光光度仪检测，此为背景读数
四、样品测定
1．移取xx微升缓冲液（reagent c）到新的比色皿
2．加入xx微升反应液（reagent d）
3．加入xx微升底物液（reagent e）
4．加入5微升待测样品（（20微克核蛋白或100微克细胞裂解萃取液蛋白））（注意：样品须清澈）
5．上下倾倒数次，混匀
6．在25℃温度下孵育2小时
7．即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数
五、计算样品活性
六、酶标板测定
1．在96孔酶标板上做好相应标记：背景对照和样品
2．分别移取xx微升缓冲液（reagent c）到96孔板中
3．分别加入xx微升反应液（reagent d）
4．分别加入xx微升底物液（reagent e）
5．分别加入xx微升阴性液（reagent f）或待测样品（20微克核蛋白或100微克细胞裂解萃取液蛋白）到相应孔中（注意：样品须清澈）
6．轻轻摇动酶标板
7．在25℃温度下孵育2小时
8．即刻放进酶标仪检测：获得背景读数和样品读数
9．活性计算：
注意事项
1．本产品为20次操作，包括背景对照
2．操作时，须戴手套
3．系统操作过程中，背景测定只需1次
4．样品须澄清，至关重要
5．用户可以选择使用核蛋白替代产品中的总蛋白制备
6．测定值由低到高变化；反应可持续2小时
7．比色测定后，比色皿须清洗
8．样本测定2小时读数高于背景读数表明具有酶活性
9．建议待测样本蛋白浓度：核蛋白为20微克/5微升；总蛋白为100微克/5微升（本公司提供bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）
10．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
11．多聚adp核糖聚合酶-1单位活性定义为：在25℃，ph 8.0条件下，每小时内能够释放1微摩尔对硝基所需的酶量作为一个活性单位
12．本公司提供系列细胞酶学检测试剂产品
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测敏感
关键词：台式离心机 酶标仪 离心机
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1．准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 x 106细胞）
2．小心加入xx毫升清理液（reagent a），覆盖生长表面
3．小心抽去清理液
4．使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用消化）
5．加入xx毫升清理液（reagent a），混匀细胞
6．移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
8．小心抽去上清液
9．加入xx微升裂解液（reagent b），充分混匀
10．转移到预冷的1.5毫升离心管
11．强力涡旋震荡15秒
12．置于冰槽里孵育30分钟
13．放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000rpm，例如eppendorf 5415）
14．小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
15．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）
16．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、测定准备
1．开启并设定好分光光度仪（温度为25℃）：波长405nm，并置零
2．从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；底物液（reagent e）避免光照；缓冲液（reagent c）室温下预热
三、背景对照测定
1．移取xx微升缓冲液（reagent c）到新的比色皿
2．加入xx微升反应液（reagent d）
3．加入xx微升底物液（reagent e）
4．加入xx微升阴性液（reagent f）
5．上下倾倒数次，混匀
6．在25℃温度下孵育2小时
7．即刻放进分光光度仪检测，此为背景读数
四、样品测定
1．移取xx微升缓冲液（reagent c）到新的比色皿
2．加入xx微升反应液（reagent d）
3．加入xx微升底物液（reagent e）
4．加入5微升待测样品（（20微克核蛋白或100微克细胞裂解萃取液蛋白））（注意：样品须清澈）
5．上下倾倒数次，混匀
6．在25℃温度下孵育2小时
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1．在96孔酶标板上做好相应标记：背景对照和样品
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3．分别加入xx微升反应液（reagent d）
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10．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
11．多聚adp核糖聚合酶-1单位活性定义为：在25℃，ph 8.0条件下，每小时内能够释放1微摩尔对硝基所需的酶量作为一个活性单位
12．本公司提供系列细胞酶学检测试剂产品
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1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测敏感
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