利用脂肪来源的干细胞和内皮细胞的骨组织工程：细胞比例的影响
对于骨的形成和再生，提供氧气和营养供应的充分的血管形成是bi;bu;ke;shao的。改善骨组织工程应用中血管形成的策略包括使用血管生成生长因子、内皮细胞（ecs）和通过动静脉袢进行手术诱导的血管生成。在许多研究中，ecs和间充质干细胞（mscs）的共培养已被证明有利于增殖和成骨分化。在临床实践方面，从骨髓中分离出的mscs 在数量和供体发病率方面可能受到限制。而来自脂肪组织的干细胞是骨髓间充质干细胞的有趣替代品。
以往的研究描述了分离、表征和多重分化潜力，并且已经表明脂肪来源的干细胞（adscs）也适用于动物的骨缺损愈合。此外，adscs在免疫调节能力和促血管生成因子和细胞外基质成分的分泌方面甚至优于mscs，特别是在与内皮细胞的共培养中，adscs的成骨分化可以进一步增加。此外，人脐静脉内皮细胞（huvecs）具有显著的血管形成能力。adscs和huvecs在组织工程应用中的共同应用似乎是增加血管形成和骨形成的有前途的方法。
基于此，德国埃尔朗根大学附属医院整形和手外科、输血科的一项研究曾探索了二维细胞培养中huvecs和成骨分化的adscs的最佳比例及其对增殖、细胞存活、成骨和血管生成的影响，为此，进行了adscs和huvecs的共培养，比例为25%：75%，50%：50%和75%：25%。通过阴性免疫选择，实验试图更详细地揭示细胞类型对细胞凋亡，血管生成和成骨分化的特定影响。
细胞增殖
在第3、7和14天进行wst-8检测测定细胞增殖。结果表明，14天后，所有组的活细胞数量均增加（图1）。7天后，含有 75% 或 25% adscs的共培养组中活细胞的数量增加。14天后，与单一培养相比，能够证明所有共培养组中有更多的活细胞。
图1 与单培养相比，共培养adscs和huvecs在7天和14天后增殖能力增强。
细胞凋亡
与huvec比例成正比，实验检测到adscs的凋亡率增加，其中75% adscs共培养组在7天和14天后的凋亡率最高（图2 a）。相反，huvecs在与adscs共培养时表现出单向减少的细胞凋亡。有趣的是，在adsc比例≥50%的共培养中，细胞凋亡在第一周更明显减少。2周后，无法检测到adsc比例对 huvecs 细胞凋亡的任何显著影响（图2 b）。为了阐明其潜在的机制，进行了磷酸化-bad蛋白（一种促凋亡蛋白）的elisa，证实了磷酸化bad的比例较低，这可能解释了共培养adscs中较高的细胞凋亡率。另一方面，发现共培养的huvecs中磷酸化bad水平的升高导致细胞凋亡减少（图2 c、d）。
图2 共培养adscs和huvecs降低了huvecs的细胞凋亡，而adscs的凋亡增加了（a，b）。在共培养时，在adscs和huvecs中评估磷酸化的蛋白bad的量，表明共培养的huvecs中磷酸化bad量较高（c，d）。
成骨分化
通过茜素红测定证明，共培养adscs和huvecs增加了基质矿化。此外，共养组的基质矿化度随着huvec比例的提高而增加。碱性磷酸酶（alp）活性是成骨分化的另一个替代参数。在第3天，观察到具有 huvecs ≥25% 的共培养组中alp活性的诱导。7天后，这种效应在所有共培养组中更加明显。
在阴性免疫选择和pcr之后，实验能够证明alp基因表达的诱导仅限于adscs。此外，实验还检测到50% adscs共培养组中alp mrna水平最高（图3 a）。此外，发现共培养后adscs中成骨转录因子runx2的水平增加。与 50% adscs共培养时，runx2表达上调幅度最大（图3 b）。
图3 阴性免疫分离后alp和runx2基因表达的pcr分析。在含有50% adscs的共培养组中，alp的表达显著增加（a）。在共培养的adscs中也观察到了runx2表达较高的趋势（b）。
血管生成
为了研究adsc / huvec共培养的血管生成潜力，进行了基质胶成管实验。与成骨分化adscs相反，未分化的adscs在基质胶中形成管状。在共培养中，管的数量和长度与huvecs的数量成比例地增加（图4 a‐h）。通过血管内皮生长因子（vegf）的elisa，能够证明在单一培养条件下adscs在第3和第7天的vegf产量最高。此外，在含有 ≥50% huvecs的共培养中，vegf的产生在第3天更加明显。第7天共培养物之间无统计学差异（图4 i）。内皮型一氧化氮合酶（enos）或基质金属蛋白酶3（mmp3）等血管生成分子的基因表达在共培养的huvecs中随着adscs比例的增加而增加。
此外，共培养刺激adscs中内皮型一氧化氮合酶（enos）、血管生成素2（ang2）和血管内皮生长因子受体1（vegf r1）的基因表达，而mmp3基因表达下调。
图4 基质胶测定表明，管数（g）和总管长（h）随着huvec比例的增加而增加。除此之外，未分化的adscs（f）形成管状。vegf elisa检测显示在单培养条件下adscs中vegf产量最高。
总之，该研究结果表明，在adscs和huvecs的共培养中，增殖、成骨分化和促血管生成特征显著增强，特别是当使用 50% adscs：50% huvecs的细胞比例时。此外，huvecs的细胞凋亡单向降低，这是由磷酸化-bad依赖性机制介导的。在骨组织工程方面，有必要进行进一步的体内研究来研究这些有前景的体外效应。
参考文献：mutschall h, winkler s, weisbach v, arkudas a, horch re, steiner d. bone tissue engineering using adipose-derived stem cells and endothelial cells: effects of the cell ratio. j cell mol med. 2020 jun;24(12):7034-7043. doi: 10.1111/jcmm.15374. epub 2020 may 12. pmid: 32394620; pmcid: pmc7299704.
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在第3、7和14天进行wst-8检测测定细胞增殖。结果表明，14天后，所有组的活细胞数量均增加（图1）。7天后，含有 75% 或 25% adscs的共培养组中活细胞的数量增加。14天后，与单一培养相比，能够证明所有共培养组中有更多的活细胞。
图1 与单培养相比，共培养adscs和huvecs在7天和14天后增殖能力增强。
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与huvec比例成正比，实验检测到adscs的凋亡率增加，其中75% adscs共培养组在7天和14天后的凋亡率最高（图2 a）。相反，huvecs在与adscs共培养时表现出单向减少的细胞凋亡。有趣的是，在adsc比例≥50%的共培养中，细胞凋亡在第一周更明显减少。2周后，无法检测到adsc比例对 huvecs 细胞凋亡的任何显著影响（图2 b）。为了阐明其潜在的机制，进行了磷酸化-bad蛋白（一种促凋亡蛋白）的elisa，证实了磷酸化bad的比例较低，这可能解释了共培养adscs中较高的细胞凋亡率。另一方面，发现共培养的huvecs中磷酸化bad水平的升高导致细胞凋亡减少（图2 c、d）。
图2 共培养adscs和huvecs降低了huvecs的细胞凋亡，而adscs的凋亡增加了（a，b）。在共培养时，在adscs和huvecs中评估磷酸化的蛋白bad的量，表明共培养的huvecs中磷酸化bad量较高（c，d）。
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图3 阴性免疫分离后alp和runx2基因表达的pcr分析。在含有50% adscs的共培养组中，alp的表达显著增加（a）。在共培养的adscs中也观察到了runx2表达较高的趋势（b）。
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此外，共培养刺激adscs中内皮型一氧化氮合酶（enos）、血管生成素2（ang2）和血管内皮生长因子受体1（vegf r1）的基因表达，而mmp3基因表达下调。
图4 基质胶测定表明，管数（g）和总管长（h）随着huvec比例的增加而增加。除此之外，未分化的adscs（f）形成管状。vegf elisa检测显示在单培养条件下adscs中vegf产量最高。
总之，该研究结果表明，在adscs和huvecs的共培养中，增殖、成骨分化和促血管生成特征显著增强，特别是当使用 50% adscs：50% huvecs的细胞比例时。此外，huvecs的细胞凋亡单向降低，这是由磷酸化-bad依赖性机制介导的。在骨组织工程方面，有必要进行进一步的体内研究来研究这些有前景的体外效应。
参考文献：mutschall h, winkler s, weisbach v, arkudas a, horch re, steiner d. bone tissue engineering using adipose-derived stem cells and endothelial cells: effects of the cell ratio. j cell mol med. 2020 jun;24(12):7034-7043. doi: 10.1111/jcmm.15374. epub 2020 may 12. pmid: 32394620; pmcid: pmc7299704.
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