Nanolive无标记显微镜揭示病毒感染活细胞的3D病变效应
瑞士nanolive公司开发的nanolive 3d cx 显微镜采用三维全息断层扫描显微技术（dhtm），该技术发表于2013年自然光学期刊【cotte et al., nature photonics7 (2013) 113–17.】。nanolive 3d cx采集样本物理学折射率图像，实现定量无标记观察；采用1类激光光源，波长520nm，温和低功率0.2mw/mm2，相当于欧洲中部太阳辐射的五分之一，因而可对样本进行几乎无干扰的实时连续观察，克服了光毒性及光漂白影响的问题。
细胞病变效应（cpes）是感染发生时的一种细胞学特征。因为光毒性的存在，当采用传统光学显微镜对细胞进行长期连续的观察时，难以客观评估细胞病变效应（cpes）。苏黎世大学的格雷博小组通过数字全息断层扫描显微技术（dhtm），发现了病毒侵染活细胞时的不同模式。全息断层扫描显微技术（dhtm）观察样本时无需标记，简化样本处理流程；低能束激光通过透明样本时记录相位差，从而使得长期连续显微观察时光毒性的问题一并解决。该技术（dhtm）可测量折射率（ri），并计算折射率梯度（rig），从而揭示细胞的光学异质性。通过研究，格博雷小组发现，痘苗病毒（vacv）、单纯疱疹病毒（hsv）和鼻病毒（rv）感染细胞可渐进性的增加折射率梯度（rig），且三种感染的折射率梯度（rig）的变化趋势与程度毒而不同。痘苗病毒感染，而非单纯疱疹病毒、鼻病毒感染，会导致细胞体积的振荡性收缩与膨胀。三种病毒感染均改变细胞膜动态，导致的凋亡特征类似于星形孢菌素的效果。作者指出，全息断层扫描显微技术（dhtm）作为定量无标记显微镜进行活细胞感染研究，在最小扰动的条件下揭示了具毒特异性的变化与细胞病变效应。
1 折射率梯度(rig)计算
折射率梯度(rig)描述了三维立体空间中特定立体像素与相邻单元之间折射率(ri)的改变，如上图所示，中心深蓝色立体像素的折射率梯度(rig)基于各维度相邻浅蓝色立体像素的折射率(ri)测算，计算公式如下：
折射率梯度(rig)由nanolive 3d cx 系统配套软件steve计算分析。
2
细胞体积测量：
细胞体积测量由软件steve及imaris完成。如上图a所示，为了衡量基于dhtm的体积测量的准确性，研究小组采用0.5um、0.75um、2um、4um的聚苯乙烯珠球进行了评估。聚苯乙烯珠球成像后的体积测算，采用两种不同的分析方法，nanolive 3d cx 系统配套软件steve，是以像素为基础的方法；第三方三维图像分析软件imaris，基于对象的的三维切面分割方法。如上图b所示，两种方法分析结果接近，imaris分析更准确一点.
nanolive 3d cx 连续观察动态视频
1，细胞形态与体积动态观察（灰阶图像）
无侵染发生hela细胞，在长达8小时的连续观察中，细胞体积恒定。
而痘苗病毒（vacv）侵染的hela细胞，细胞体积经历了振荡性的收缩与膨胀。链接视频1：痘苗病毒（vacv）侵染hela细胞体积变化。
视频链接：/v_show/id_xndyymtg4otgwoa==.html
2，药物处理抑制鼻病毒诱导的折射率增加（数字染色图像）。其中，细胞膜绿色标记，高折射率与高折射率梯度区域红色标记。
相对于无侵染hela细胞，鼻病毒（rv）侵染hela细胞为代表的折射率梯度（rig）显著增加了2.5倍（视频链接2）；当研究小组使用抑制剂mln9708(10um)处理鼻病毒感染细胞时，可以明显挽救折射率梯度（rig）增加的表型（视频链接3）。
视频链接2：鼻病毒（rv）侵染hela细胞折射率梯度（rig）变化
视频链接：/v_show/id_xndyymtg5mdi2oa==.html
视频链接3：鼻病毒（rv）侵染hela细胞，mln9708（10um）处理后细胞折射率梯度（rig）变化/v_show/id_xndyymtg5mdu2ma==.html
2，药物处理抑制鼻病毒诱导的折射率增加（数字染色图像）。其中，细胞膜绿色标记，高折射率与高折射率梯度区域红色标记。
相对于无侵染hela细胞，鼻病毒（rv）侵染hela细胞为代表的折射率梯度（rig）显著增加了2.5倍（视频链接2）；当研究小组使用抑制剂mln9708(10um)处理鼻病毒感染细胞时，可以明显挽救折射率梯度（rig）增加的表型（视频链接3）。
视频链接2：鼻病毒（rv）侵染hela细胞折射率梯度（rig）变化
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1 折射率梯度(rig)计算
折射率梯度(rig)描述了三维立体空间中特定立体像素与相邻单元之间折射率(ri)的改变，如上图所示，中心深蓝色立体像素的折射率梯度(rig)基于各维度相邻浅蓝色立体像素的折射率(ri)测算，计算公式如下：
折射率梯度(rig)由nanolive 3d cx 系统配套软件steve计算分析。
2
细胞体积测量：
细胞体积测量由软件steve及imaris完成。如上图a所示，为了衡量基于dhtm的体积测量的准确性，研究小组采用0.5um、0.75um、2um、4um的聚苯乙烯珠球进行了评估。聚苯乙烯珠球成像后的体积测算，采用两种不同的分析方法，nanolive 3d cx 系统配套软件steve，是以像素为基础的方法；第三方三维图像分析软件imaris，基于对象的的三维切面分割方法。如上图b所示，两种方法分析结果接近，imaris分析更准确一点.
nanolive 3d cx 连续观察动态视频
1，细胞形态与体积动态观察（灰阶图像）
无侵染发生hela细胞，在长达8小时的连续观察中，细胞体积恒定。
而痘苗病毒（vacv）侵染的hela细胞，细胞体积经历了振荡性的收缩与膨胀。链接视频1：痘苗病毒（vacv）侵染hela细胞体积变化。
视频链接：/v_show/id_xndyymtg4otgwoa==.html
2，药物处理抑制鼻病毒诱导的折射率增加（数字染色图像）。其中，细胞膜绿色标记，高折射率与高折射率梯度区域红色标记。
相对于无侵染hela细胞，鼻病毒（rv）侵染hela细胞为代表的折射率梯度（rig）显著增加了2.5倍（视频链接2）；当研究小组使用抑制剂mln9708(10um)处理鼻病毒感染细胞时，可以明显挽救折射率梯度（rig）增加的表型（视频链接3）。
视频链接2：鼻病毒（rv）侵染hela细胞折射率梯度（rig）变化
视频链接：/v_show/id_xndyymtg5mdi2oa==.html
视频链接3：鼻病毒（rv）侵染hela细胞，mln9708（10um）处理后细胞折射率梯度（rig）变化/v_show/id_xndyymtg5mdu2ma==.html
2，药物处理抑制鼻病毒诱导的折射率增加（数字染色图像）。其中，细胞膜绿色标记，高折射率与高折射率梯度区域红色标记。
相对于无侵染hela细胞，鼻病毒（rv）侵染hela细胞为代表的折射率梯度（rig）显著增加了2.5倍（视频链接2）；当研究小组使用抑制剂mln9708(10um)处理鼻病毒感染细胞时，可以明显挽救折射率梯度（rig）增加的表型（视频链接3）。
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