PCR实验操作程序介绍
1. 在无菌的0.5ml或0.2ml离心管中按下列操作程序加样：
反应物 加样顺序 体积(μl) 终浓度
去离子水 1 29.4
10×buffer b 2 5 1×
4×dntp混合物 3 5 各200μmol/l
mgcl2 4 3 1.5mmol/l
有义引物 5 2.6 0.25μmol/l
反义引物 6 2.6 0.25μmol/l
模板 7 2 0.1μg
taqdna聚合酶 8 0.4 1unit
2. 用微量可调加样器和一次性tip向每一管中加50μl矿物油。每加一管换一次tip。
3. 振荡每只管，然后短暂离心。
4. 将管放到预热的热循环中，按下列程序开始循环：
预变性 94℃ 4分钟 1次
变性 94℃ 1分钟
退火 37-65℃ 1分钟
延伸 72℃ 1分钟
循环30次
终延伸 72℃ 7分钟 1次
保存 4℃
5. 将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，分析结果。电泳条件：60-80v,15-20分钟。
6. 紫外分析仪检查电泳结果。
四、讨论
1.假阴性，不出现扩增条带
pcr反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量，④pcr循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有taq酶抑制剂，②在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。③模板核酸变性不底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，有可能是模板核酸提取过程出了毛病，可使用阳性对照的dna模板配合检查模板质量。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是pcr失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看od值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做pcr有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
mg2+浓度：mg2+离子浓度对pcr扩增效率影响很大，浓度过高可降低pcr扩增的特异性，浓度过低则影响pcr扩增产量甚至使pcr扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行pcr扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul、或100ul，应用多大体积进行pcr扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul
后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对pcr扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率，退火温度过高影响引物与模板的结合而降低pcr扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下
扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是pcr失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其pcr扩增是不会成功的。
2.假阳性
出现的pcr扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行pcr扩增
时，扩增出的pcr产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：
①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。
③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出pcr产物，而导致假阳性的产生，可用巢式pcr方法来减轻或消除。
3.出现非特异性扩增带
pcr扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不全互补、或引物聚合形成二聚体。二是mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及pcr循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：
①必要时重新设计引物。
②减低酶量或调换另一来源的酶。
③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。
④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
4.出现片状拖带或涂抹带
pcr扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量
差，dntp浓度过高，mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：
①减少酶量，或调换另一来源的酶。
②减少dntp的浓度。
③适当降低mg2+浓度。
④增加模板量，减少循环次数。
1.4028不锈钢成分性能介绍及标准
风速仪与热式风速仪的测量方法与应用
加工中心加工零件精度的概念
氨氮分析仪：高精度氨氮检测设备
如何选择合适的工业平板电脑?
PCR实验操作程序介绍
上海水汽老化箱科研创新的起点
呼气式/排查式二合一酒安6900呼气酒精检测仪价格
黄酮类化合物提取产品特点
电子天平的注意事项有哪些？
EPS无机渗透板设备生产线原理与构造
《固态电压标准检定规程》征求意见
缓蚀剂系列加药装置主要特点及控制说明
意大利ATOS电动阀和电磁阀的用途对比
分享散装机在操作时的注意事项
喷涂废气处理设备的这些处理方法，你了解几个？
应用案例14 | 阿卡波糖
数控机床的组件类型
防腐性磁翻板液位计使用时应注意哪些事项
FCL-2039带电电缆路径仪
反应物 加样顺序 体积(μl) 终浓度
去离子水 1 29.4
10×buffer b 2 5 1×
4×dntp混合物 3 5 各200μmol/l
mgcl2 4 3 1.5mmol/l
有义引物 5 2.6 0.25μmol/l
反义引物 6 2.6 0.25μmol/l
模板 7 2 0.1μg
taqdna聚合酶 8 0.4 1unit
2. 用微量可调加样器和一次性tip向每一管中加50μl矿物油。每加一管换一次tip。
3. 振荡每只管，然后短暂离心。
4. 将管放到预热的热循环中，按下列程序开始循环：
预变性 94℃ 4分钟 1次
变性 94℃ 1分钟
退火 37-65℃ 1分钟
延伸 72℃ 1分钟
循环30次
终延伸 72℃ 7分钟 1次
保存 4℃
5. 将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，分析结果。电泳条件：60-80v,15-20分钟。
6. 紫外分析仪检查电泳结果。
四、讨论
1.假阴性，不出现扩增条带
pcr反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量，④pcr循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有taq酶抑制剂，②在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。③模板核酸变性不底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，有可能是模板核酸提取过程出了毛病，可使用阳性对照的dna模板配合检查模板质量。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是pcr失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看od值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做pcr有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
mg2+浓度：mg2+离子浓度对pcr扩增效率影响很大，浓度过高可降低pcr扩增的特异性，浓度过低则影响pcr扩增产量甚至使pcr扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行pcr扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul、或100ul，应用多大体积进行pcr扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul
后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对pcr扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率，退火温度过高影响引物与模板的结合而降低pcr扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下
扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是pcr失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其pcr扩增是不会成功的。
2.假阳性
出现的pcr扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行pcr扩增
时，扩增出的pcr产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：
①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。
③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出pcr产物，而导致假阳性的产生，可用巢式pcr方法来减轻或消除。
3.出现非特异性扩增带
pcr扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不全互补、或引物聚合形成二聚体。二是mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及pcr循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：
①必要时重新设计引物。
②减低酶量或调换另一来源的酶。
③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。
④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
4.出现片状拖带或涂抹带
pcr扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量
差，dntp浓度过高，mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：
①减少酶量，或调换另一来源的酶。
②减少dntp的浓度。
③适当降低mg2+浓度。
④增加模板量，减少循环次数。
1.4028不锈钢成分性能介绍及标准
风速仪与热式风速仪的测量方法与应用
加工中心加工零件精度的概念
氨氮分析仪：高精度氨氮检测设备
如何选择合适的工业平板电脑?
PCR实验操作程序介绍
上海水汽老化箱科研创新的起点
呼气式/排查式二合一酒安6900呼气酒精检测仪价格
黄酮类化合物提取产品特点
电子天平的注意事项有哪些？
EPS无机渗透板设备生产线原理与构造
《固态电压标准检定规程》征求意见
缓蚀剂系列加药装置主要特点及控制说明
意大利ATOS电动阀和电磁阀的用途对比
分享散装机在操作时的注意事项
喷涂废气处理设备的这些处理方法，你了解几个？
应用案例14 | 阿卡波糖
数控机床的组件类型
防腐性磁翻板液位计使用时应注意哪些事项
FCL-2039带电电缆路径仪