RT-PCR实验反应体系灵敏度提升方法汇总
增加反应体系的灵敏度：
1. 分离高质量rna：
成功的cdna合成来自高质量的rna。高质量的rna至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如edta或sds。rna的质量决定了你能够转录到 cdna上的序列信息量的最大值。一般的rna纯化方法是使用异硫氰酸胍/酸性酚的一步法。为了防止痕量rnase的污染，从富含rnase的样品(如胰脏)中分离到的rna需要贮存在甲醛中以保存高质量的rna，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的rna，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的rna，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量rnase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存rna样品的稳定性，可以将rna溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存rna的甲酰胺一定不能含有降解rna的杂物。来源于胰脏的rna至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用rna时，可以使用下列方法沉淀rna：加入nacl至0.2m及4倍体积的乙醇，室温放置3-5分钟，10,000×g离心5分钟。
2. 使用无rnaseh活性(rnaseh-)的逆转录酶：
在逆转录反应中经常加入rnase抑制剂以增加cdna合成的长度和产量。rnase抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂(如dtt)存在的条件下加入，因为cdna合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解rna的rnase。蛋白rnase抑制剂仅防止rnase a，b，c对rna的降解，并不能防止皮肤上的rnase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指上引入rnase。
逆转录酶催化rna转化成cdna。不管是m-mlv还是amv，在本身的聚合酶活性之外，都具有内源rnaseh活性。rnaseh活性同聚合酶活性相互竞争rna模板与dna引物或cdna延伸链间形成的杂合链，并降解rna：dna复合物中的rna链。被rnaseh活性所降解的rna模板不能再作为合成cdna的有效底物，降低了cdna合成的产量和长度。因此消除或大大降低逆转录酶的rnaseh活性将会大有裨益。
superscriptⅱ逆转录酶，rnaseh- 的mmlv逆转录酶及thermoscript逆转录酶，rnaseh- 的 amv，比mmlv和amv得到更多量和更多全长的cdna。rt-pcr灵敏度会受cdna合成量的影响。thermoscript比amv的灵敏性强得多。rt-pcr产物的大小受限于逆转录酶合成cdna的能力，尤其是克隆较大的cdna时。同mmlv相比，superscripⅱ显著提高了长 rt-pcr产物的产量。rnaseh- 的逆转录酶同时增加了热稳定性，所以反应可以在高于正常的37-42℃的温度下进行。在建议的合成条件下，使用oligo(dt)引物和10μci的 [α-p]dctp。第一链的总产量使用tca沉淀法计算。全长cdna使用在碱性琼脂糖胶上将大小分类的条带切除并计数的方法分析。
3. 提高逆转录保温温度：
较高的保温温度有助于rna二级结构的打开，增加了反应的产量。对于多数rna模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将rna和引物在65℃保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使引物可以结合。然而某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。对这些困难模板的扩增可以使用 thermoscript逆转录酶，并将逆转录反应置于较高温度下进行以改善扩增。较高的保温温度也可以增加特异性，尤其是当使用基因特异性引物(gsp)进行cdna合成时(见第三章)。如果使用gsp，确保引物的tm值与预计的保温温度相同。不要在高于60℃时使用oligo(dt)和随机引物。随机引物需要在增加到60℃前在25℃保温10分钟。除了使用较高的逆转录温度外，还可以通过直接将rna/引物混合物从65℃变性温度转到逆转录保温温度，并加入预热的2×的反应混合物提高特异性(cdna热启动合成)。这种方法有助于防止较低温度时所发生的分子间碱基配对。使用pcr仪可以简化 rt-pcr所需的多种温度切换。
tth热稳定聚合酶在mg2+存在条件下作为dna聚合酶，在mn2+存在条件下作为rna聚合酶。它可以在最高65℃条件下保温。然而，pcr过程中mn2+的存在会降低忠实性，这使得tth 聚合酶不太适合用于高精确度的扩增，如cdna的克隆。另外，tth的逆转录效率较低，这会降低灵敏度，而且，既然单个酶就可以进行逆转录和pcr，那么没有逆转录的对照反应就不能用来将cdna的扩增产物同污染的基因组dna的扩增产物区分开来。
4. 促进逆转录的添加剂：
包括甘油和dmso在内的添加剂加到第一链合成反应中，可以减低核酸双链的稳定并解开rna二级结构，最多可以加入20%的甘油或10%的dmso而不影响superscriptⅱ或mmlv的活性。amv也可以耐受最多20%的甘油而不降低活性。为了在superscriptⅱ逆转录反应中最大限度提高rt-pcr的灵敏度，可以加入10%的甘油并在45℃保温。如果1/10的逆转录反应产物加入到pcr中，那甘油在扩增反应中的浓度为0.4%，这不足以抑制pcr。
5. rnaseh处理：
在pcr之前使用rnaseh处理cdna合成反应可以提高灵敏度。对于某些模板，据认为cdna合成反应中的rna会阻止扩增产物的结合，在这种情况下，rnaseh处理可以增加灵敏度。一般当扩增较长的全长cdna目标模板时，rnaseh处理是必需的，比如低拷贝的tuberous scherosisⅱ。对这种困难模板，rnaseh的处理加强了superscriptⅱ或amv合成的cdna所产生的信号。对于多数rt-pcr反应，rnaseh处理是可选的，因为95℃保温的pcr变性步骤一般会将rna：dna复合物中的rna水解掉。
6.小量rna检测方法的提高：
当仅有小量rna时，rt-pcr尤其具有挑战性。在rna分离过程中加入的作为载体的糖元有助于增加小量样品的产量。可以在加入trizol的同时加入无rnase的糖元。糖元是水溶性的，可以同rna保持在水相中以辅助随后的沉淀。对于小于50mg的组织或106个培养细胞的样品，无rnase糖元的建议浓度为250μg/ml。
在使用superscriptⅱ的逆转录反应中加入乙酰化bsa可以增加灵敏度，而且对于小量rna，减少superscriptⅱ的量并加入40单位的rnaseout核酸酶抑制剂可以提高检测的水平。如果在rna分离过程中使用了糖元，仍然建议在使用superscriptⅱ进行逆转录反应时加入 bsa或rnase抑制剂。
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成功的cdna合成来自高质量的rna。高质量的rna至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如edta或sds。rna的质量决定了你能够转录到 cdna上的序列信息量的最大值。一般的rna纯化方法是使用异硫氰酸胍/酸性酚的一步法。为了防止痕量rnase的污染，从富含rnase的样品(如胰脏)中分离到的rna需要贮存在甲醛中以保存高质量的rna，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的rna，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的rna，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量rnase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存rna样品的稳定性，可以将rna溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存rna的甲酰胺一定不能含有降解rna的杂物。来源于胰脏的rna至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用rna时，可以使用下列方法沉淀rna：加入nacl至0.2m及4倍体积的乙醇，室温放置3-5分钟，10,000×g离心5分钟。
2. 使用无rnaseh活性(rnaseh-)的逆转录酶：
在逆转录反应中经常加入rnase抑制剂以增加cdna合成的长度和产量。rnase抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂(如dtt)存在的条件下加入，因为cdna合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解rna的rnase。蛋白rnase抑制剂仅防止rnase a，b，c对rna的降解，并不能防止皮肤上的rnase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指上引入rnase。
逆转录酶催化rna转化成cdna。不管是m-mlv还是amv，在本身的聚合酶活性之外，都具有内源rnaseh活性。rnaseh活性同聚合酶活性相互竞争rna模板与dna引物或cdna延伸链间形成的杂合链，并降解rna：dna复合物中的rna链。被rnaseh活性所降解的rna模板不能再作为合成cdna的有效底物，降低了cdna合成的产量和长度。因此消除或大大降低逆转录酶的rnaseh活性将会大有裨益。
superscriptⅱ逆转录酶，rnaseh- 的mmlv逆转录酶及thermoscript逆转录酶，rnaseh- 的 amv，比mmlv和amv得到更多量和更多全长的cdna。rt-pcr灵敏度会受cdna合成量的影响。thermoscript比amv的灵敏性强得多。rt-pcr产物的大小受限于逆转录酶合成cdna的能力，尤其是克隆较大的cdna时。同mmlv相比，superscripⅱ显著提高了长 rt-pcr产物的产量。rnaseh- 的逆转录酶同时增加了热稳定性，所以反应可以在高于正常的37-42℃的温度下进行。在建议的合成条件下，使用oligo(dt)引物和10μci的 [α-p]dctp。第一链的总产量使用tca沉淀法计算。全长cdna使用在碱性琼脂糖胶上将大小分类的条带切除并计数的方法分析。
3. 提高逆转录保温温度：
较高的保温温度有助于rna二级结构的打开，增加了反应的产量。对于多数rna模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将rna和引物在65℃保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使引物可以结合。然而某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。对这些困难模板的扩增可以使用 thermoscript逆转录酶，并将逆转录反应置于较高温度下进行以改善扩增。较高的保温温度也可以增加特异性，尤其是当使用基因特异性引物(gsp)进行cdna合成时(见第三章)。如果使用gsp，确保引物的tm值与预计的保温温度相同。不要在高于60℃时使用oligo(dt)和随机引物。随机引物需要在增加到60℃前在25℃保温10分钟。除了使用较高的逆转录温度外，还可以通过直接将rna/引物混合物从65℃变性温度转到逆转录保温温度，并加入预热的2×的反应混合物提高特异性(cdna热启动合成)。这种方法有助于防止较低温度时所发生的分子间碱基配对。使用pcr仪可以简化 rt-pcr所需的多种温度切换。
tth热稳定聚合酶在mg2+存在条件下作为dna聚合酶，在mn2+存在条件下作为rna聚合酶。它可以在最高65℃条件下保温。然而，pcr过程中mn2+的存在会降低忠实性，这使得tth 聚合酶不太适合用于高精确度的扩增，如cdna的克隆。另外，tth的逆转录效率较低，这会降低灵敏度，而且，既然单个酶就可以进行逆转录和pcr，那么没有逆转录的对照反应就不能用来将cdna的扩增产物同污染的基因组dna的扩增产物区分开来。
4. 促进逆转录的添加剂：
包括甘油和dmso在内的添加剂加到第一链合成反应中，可以减低核酸双链的稳定并解开rna二级结构，最多可以加入20%的甘油或10%的dmso而不影响superscriptⅱ或mmlv的活性。amv也可以耐受最多20%的甘油而不降低活性。为了在superscriptⅱ逆转录反应中最大限度提高rt-pcr的灵敏度，可以加入10%的甘油并在45℃保温。如果1/10的逆转录反应产物加入到pcr中，那甘油在扩增反应中的浓度为0.4%，这不足以抑制pcr。
5. rnaseh处理：
在pcr之前使用rnaseh处理cdna合成反应可以提高灵敏度。对于某些模板，据认为cdna合成反应中的rna会阻止扩增产物的结合，在这种情况下，rnaseh处理可以增加灵敏度。一般当扩增较长的全长cdna目标模板时，rnaseh处理是必需的，比如低拷贝的tuberous scherosisⅱ。对这种困难模板，rnaseh的处理加强了superscriptⅱ或amv合成的cdna所产生的信号。对于多数rt-pcr反应，rnaseh处理是可选的，因为95℃保温的pcr变性步骤一般会将rna：dna复合物中的rna水解掉。
6.小量rna检测方法的提高：
当仅有小量rna时，rt-pcr尤其具有挑战性。在rna分离过程中加入的作为载体的糖元有助于增加小量样品的产量。可以在加入trizol的同时加入无rnase的糖元。糖元是水溶性的，可以同rna保持在水相中以辅助随后的沉淀。对于小于50mg的组织或106个培养细胞的样品，无rnase糖元的建议浓度为250μg/ml。
在使用superscriptⅱ的逆转录反应中加入乙酰化bsa可以增加灵敏度，而且对于小量rna，减少superscriptⅱ的量并加入40单位的rnaseout核酸酶抑制剂可以提高检测的水平。如果在rna分离过程中使用了糖元，仍然建议在使用superscriptⅱ进行逆转录反应时加入 bsa或rnase抑制剂。
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