不用Trizol即可裂解细胞提取RNA的方法
1、方法一
试剂：
（1）变性液组成：25 g异硫氰酸胍溶于33 ml csb中（42 mmol/l ph4.0乙酸钠、0.83%十二烷基肌氨酸钠、0.2 mmol/l β-巯基乙醇），65 ℃溶解，过滤灭菌，4 ℃预冷。
（2）酸性酚配制：55 ℃时，500 g酚溶入500 ml 50 mmol/l，ph4.0乙酸钠，混匀，静止分层后，去上清，再反复加500 ml 50 mmol/l，ph4.0乙酸钠，直到ph。
操作步骤：
（1）细胞收集：含一定浓度的细胞培养液置于无菌离心管中，4 ℃，3000 g离心5min；
（2）细胞洗涤：上步沉淀用25毫升灭菌后冰冻的1×pbs缓冲液洗涤，然后4℃，3000 g离心5 min；
（3）细胞破碎：在沉淀细胞中加入15毫升预冷的变性液，用无菌处理过的匀浆器匀浆；
（4）在经变性液匀浆的细胞或组织600 μl＋60 μl ph4.0的2 mmol/l乙酸钠*混匀，可用漩涡振荡器600 μl酚\氯-仿\异-戊醇（25\24\1），*混匀或漩涡振荡器振荡10 s，冰浴10-15 min，离心，4 ℃，10000 g，20 min，上层水相吸至无菌离心管中，加等体积的异丙醇，-70℃，30 min沉淀rna，离心4 ℃，10000 g，20 min；沉淀rna，冷冻干燥15 min，rna沉淀重新溶于300 μl变性液中.
可振荡（有时为了帮助溶解，可在65 ℃加热，但时间应极短）60 μl ph4.0的2 mmol/l乙酸钠*混匀，可用漩涡振荡器，600 μl酚\氯-仿\异-戊醇（25\24\1），*混匀或漩涡振荡器振荡10 s，冰裕中10-15 min，离心，4℃，10000 g，20 min，上层水相吸至无菌离心管中，等体积异丙醇二次沉淀（-70℃，30 min），75％乙醇洗沉淀，沉淀冷冻干燥，复溶于去rna酶的水中（对于准备*保存的rna可加入ph 5.0的乙酸钠至终浓度为0.25 mmol/l，再加入2.5体积的乙醇，-70 ℃保存）。
2、方法二
氯化锂法提取总rna 方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制rna酶，用氯化锂选择沉淀rna，其特别适合于从大量样品中提取少量组织rna，具有快速简洁的长处，但也存在少量dna的污染及rna得率不高，小rna-片断丢失的缺陷。
试剂：
（1）氯化锂/尿素溶液：氯化锂126 g（3 mmol/l）尿素、360 g（6 mmol/l）加水至1 l，过滤灭菌
（2）悬浮液：10 mmol/l tris-hcl （ph7.6），1 mmol/l edta （ph8.0），0.5%sds
操作步骤：
（1）对于大量组织或细胞，则每克组织或细胞加入5-10 ml氯化锂－尿素溶液，匀桨器高速匀桨2 min，对于少量细胞（107细胞/ml），则每克组织或细胞加入0.5 ml氯化锂－尿素溶液手工匀桨，并转移至eppendof管中；
（2）匀桨液在0-4 ℃放置4 h后，12000 g离心30 min；
（3）取沉淀，加入原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液，重复步骤（2）；
（4）沉淀用原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液复溶后，加入等体积酚/氯-仿/异戊醇在室温放置15－30 min并不时摇动混匀，4000g离心5 min；
（5）取上层水相，加1/10倍体积的3 mmol/l乙酸钠（ph5.2）及2倍体积的乙醇，-20 ℃放置1 h，5000 g离心；
（6）70％乙醇洗沉淀一次，真空干燥；
（7）rna溶解液溶解沉淀，得rna，分装，于-70℃保存。
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（1）变性液组成：25 g异硫氰酸胍溶于33 ml csb中（42 mmol/l ph4.0乙酸钠、0.83%十二烷基肌氨酸钠、0.2 mmol/l β-巯基乙醇），65 ℃溶解，过滤灭菌，4 ℃预冷。
（2）酸性酚配制：55 ℃时，500 g酚溶入500 ml 50 mmol/l，ph4.0乙酸钠，混匀，静止分层后，去上清，再反复加500 ml 50 mmol/l，ph4.0乙酸钠，直到ph。
操作步骤：
（1）细胞收集：含一定浓度的细胞培养液置于无菌离心管中，4 ℃，3000 g离心5min；
（2）细胞洗涤：上步沉淀用25毫升灭菌后冰冻的1×pbs缓冲液洗涤，然后4℃，3000 g离心5 min；
（3）细胞破碎：在沉淀细胞中加入15毫升预冷的变性液，用无菌处理过的匀浆器匀浆；
（4）在经变性液匀浆的细胞或组织600 μl＋60 μl ph4.0的2 mmol/l乙酸钠*混匀，可用漩涡振荡器600 μl酚\氯-仿\异-戊醇（25\24\1），*混匀或漩涡振荡器振荡10 s，冰浴10-15 min，离心，4 ℃，10000 g，20 min，上层水相吸至无菌离心管中，加等体积的异丙醇，-70℃，30 min沉淀rna，离心4 ℃，10000 g，20 min；沉淀rna，冷冻干燥15 min，rna沉淀重新溶于300 μl变性液中.
可振荡（有时为了帮助溶解，可在65 ℃加热，但时间应极短）60 μl ph4.0的2 mmol/l乙酸钠*混匀，可用漩涡振荡器，600 μl酚\氯-仿\异-戊醇（25\24\1），*混匀或漩涡振荡器振荡10 s，冰裕中10-15 min，离心，4℃，10000 g，20 min，上层水相吸至无菌离心管中，等体积异丙醇二次沉淀（-70℃，30 min），75％乙醇洗沉淀，沉淀冷冻干燥，复溶于去rna酶的水中（对于准备*保存的rna可加入ph 5.0的乙酸钠至终浓度为0.25 mmol/l，再加入2.5体积的乙醇，-70 ℃保存）。
2、方法二
氯化锂法提取总rna 方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制rna酶，用氯化锂选择沉淀rna，其特别适合于从大量样品中提取少量组织rna，具有快速简洁的长处，但也存在少量dna的污染及rna得率不高，小rna-片断丢失的缺陷。
试剂：
（1）氯化锂/尿素溶液：氯化锂126 g（3 mmol/l）尿素、360 g（6 mmol/l）加水至1 l，过滤灭菌
（2）悬浮液：10 mmol/l tris-hcl （ph7.6），1 mmol/l edta （ph8.0），0.5%sds
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（1）对于大量组织或细胞，则每克组织或细胞加入5-10 ml氯化锂－尿素溶液，匀桨器高速匀桨2 min，对于少量细胞（107细胞/ml），则每克组织或细胞加入0.5 ml氯化锂－尿素溶液手工匀桨，并转移至eppendof管中；
（2）匀桨液在0-4 ℃放置4 h后，12000 g离心30 min；
（3）取沉淀，加入原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液，重复步骤（2）；
（4）沉淀用原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液复溶后，加入等体积酚/氯-仿/异戊醇在室温放置15－30 min并不时摇动混匀，4000g离心5 min；
（5）取上层水相，加1/10倍体积的3 mmol/l乙酸钠（ph5.2）及2倍体积的乙醇，-20 ℃放置1 h，5000 g离心；
（6）70％乙醇洗沉淀一次，真空干燥；
（7）rna溶解液溶解沉淀，得rna，分装，于-70℃保存。
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