细菌呼吸链复合物II活性比色法定量检测试剂盒产品说明书
细菌呼吸链复合物ii活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）
主要用途
细菌呼吸链复合物ii（琥珀酸－辅酶q还原酶）活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用合成辅酶q同功类似物二氯酚靛酚，通过反应系统测定样品中二氯酚靛酚还原后吸光峰值的变化，即采用比色法测定样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种野生、培养或病原性细菌膜蛋白悬液样品的琥珀酸－辅酶q还原酶的特异性活性检测。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。
技术背景
细菌呼吸链复合物ii，通常称为琥珀酸－辅酶q还原酶或琥珀酸脱氢酶（succinate-coenzyme q oxidoreductase；succinate dehydrogenase；sqr），结构和功能上类同于线粒体复合物ii，膜结合型，是细菌需氧呼吸链与三羧酸循环链接的主要元素：含有四个亚体，铁硫中心（fe-s clusters），辅因子为黄素（flavin）。其最特征性的酶活性是噻吩甲酰三氟丙酮（thenoyltrifluoroacetone；ttfa）敏感的琥珀酸－辅酶q还原酶。复合物ii催化琥珀酸（succinate）被氧化为富马酸（fumarate），细菌内电子由供体黄素传递到内膜上辅酶q受体（泛醌；ubiquinone）的能量转移反应，进行呼吸链传递。基于琥珀酸底物，通过琥珀酸－辅酶q还原酶的催化，氧化为富马酸，同时氧化型二氯酚靛酚（dichlorophenal-indophenol；dcpip）转化为还原型二氯酚靛酚（dichlorophenal-indophenol；dcpiph2），在分光光度仪下产生吸光峰值的变化（600nm 波长），由此定量测定琥珀酸－辅酶q还原酶的特异活性。其反应系统是：
产品内容
缓冲液（reagent a） 毫升
反应液（reagent b） 毫升
阴性液（reagent c） 毫升
底物液（reagent d） 微升
产品说明书 1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；反应液（reagent b）和底物液（reagent d），避免光照，有效保证6月
用户自备
比色皿：用于比色的容器
分光光度仪：用于比色分析
培养箱：用于孵育反应物
实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；缓冲液（reagent a）室温预热；反应液（reagent b）和底物液（reagent d）注意避光。然后进行下列操作。
一、测定准备
1．准备好待测样品（例如细菌膜蛋白样品等），置于冰槽里
2．设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为600nm，间隔60秒，读数6次（共5分钟），并置零
二、背景对照测定
1．移取xx微升缓冲液（reagent a）到新的比色皿
2．加入xx微升反应液（reagent b）
3．加入xx微升底物液（reagent d）
4．上下倾倒数次，混匀
5．放进30℃培养箱里静置3分钟
6．加入xx微升阴性液（reagent c）
7．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8．即刻放入分光光度仪检测，此为背景空对照：600波长读数0分钟－600波长读数1分钟或5分钟
三、样品活性测定
1．移取xx微升缓冲液（reagent a）到新的比色皿
2．加入xx微升反应液（reagent b）
3．加入xx微升底物液（reagent d）
4．上下倾倒数次，混匀
5．放进30℃培养箱里静置3分钟
6．加入100微升待测样品（注意：50微克细菌膜蛋白）
7．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8．即刻放入分光光度仪检测，此为样品活性读数：600波长读数0分钟－600波长读数1分钟或5分钟
四、计算样品活性
注意事项
1．本产品为21次操作，包括背景对照
2．操作时，须戴手套
3．反应液（reagent b）含有毒性物质，避免直接用手接触
4．系统操作过程中，背景测定只需1次
5．如果增强酶活检测，建议使用细菌膜蛋白样品。推荐线粒体复合物待测样品预处理试剂盒－10342
6．加入样品启动反应后3秒内即刻比色测定
7．96孔板测定初始读数（0分钟读数）0.5左右为理想状态；比色皿测定为1.0左右
8．反应1分钟后比色测定值趋于稳定；测定值由高到低变化；测定可以持续5分钟
9．测定值由高到低变化，即5分钟测定读数低于0分钟测定读数，表明有酶活性
10．比色测定后，比色皿须清洗
11．建议待测样本蛋白浓度为50微克/100微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量；注意计算公式的调整
12．呼吸链复合物ii（琥珀酸－辅酶q还原酶）单位活性定义为：在30℃，ph 7.5条件下，每分钟内能够还原1微摩尔合成辅酶q同功类似物二氯酚靛酚（dcpip）所需的酶量作为一个活性单位
13．本公司提供系列细菌酶类技术产品
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测准确
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技术背景
细菌呼吸链复合物ii，通常称为琥珀酸－辅酶q还原酶或琥珀酸脱氢酶（succinate-coenzyme q oxidoreductase；succinate dehydrogenase；sqr），结构和功能上类同于线粒体复合物ii，膜结合型，是细菌需氧呼吸链与三羧酸循环链接的主要元素：含有四个亚体，铁硫中心（fe-s clusters），辅因子为黄素（flavin）。其最特征性的酶活性是噻吩甲酰三氟丙酮（thenoyltrifluoroacetone；ttfa）敏感的琥珀酸－辅酶q还原酶。复合物ii催化琥珀酸（succinate）被氧化为富马酸（fumarate），细菌内电子由供体黄素传递到内膜上辅酶q受体（泛醌；ubiquinone）的能量转移反应，进行呼吸链传递。基于琥珀酸底物，通过琥珀酸－辅酶q还原酶的催化，氧化为富马酸，同时氧化型二氯酚靛酚（dichlorophenal-indophenol；dcpip）转化为还原型二氯酚靛酚（dichlorophenal-indophenol；dcpiph2），在分光光度仪下产生吸光峰值的变化（600nm 波长），由此定量测定琥珀酸－辅酶q还原酶的特异活性。其反应系统是：
产品内容
缓冲液（reagent a） 毫升
反应液（reagent b） 毫升
阴性液（reagent c） 毫升
底物液（reagent d） 微升
产品说明书 1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；反应液（reagent b）和底物液（reagent d），避免光照，有效保证6月
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比色皿：用于比色的容器
分光光度仪：用于比色分析
培养箱：用于孵育反应物
实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；缓冲液（reagent a）室温预热；反应液（reagent b）和底物液（reagent d）注意避光。然后进行下列操作。
一、测定准备
1．准备好待测样品（例如细菌膜蛋白样品等），置于冰槽里
2．设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为600nm，间隔60秒，读数6次（共5分钟），并置零
二、背景对照测定
1．移取xx微升缓冲液（reagent a）到新的比色皿
2．加入xx微升反应液（reagent b）
3．加入xx微升底物液（reagent d）
4．上下倾倒数次，混匀
5．放进30℃培养箱里静置3分钟
6．加入xx微升阴性液（reagent c）
7．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8．即刻放入分光光度仪检测，此为背景空对照：600波长读数0分钟－600波长读数1分钟或5分钟
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1．移取xx微升缓冲液（reagent a）到新的比色皿
2．加入xx微升反应液（reagent b）
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四、计算样品活性
注意事项
1．本产品为21次操作，包括背景对照
2．操作时，须戴手套
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4．系统操作过程中，背景测定只需1次
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