PCR基因扩增原理和基本程序
基因扩增技术（pcr）聚合酶链反应（polymerase chain reaction简称pcr）又称无细胞分子克隆系统或特异性dna序列体外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重大革新。可将极微量的靶dna特异地扩增上百万倍，从而大大提高对dna分子的分析和检测能力，能检测单分子dna或对每10万个细胞中仅含1个靶dna分子的样品，因而此方法立即在分子生物学、微生物学、医学及遗传学等多领域广泛应用和迅速发展。由于pcr具有敏感性高、特异性强、快速、简便等优点，已在病原微生物学领域中显示出巨大的应用价值和广阔的发展前景。
pcr技术是由cetus公司和加利福尼亚大学1985年联合创造的，主要贡献者为kary b mulis和henerya、erlich。该方法首先被应用于人β-珠蛋白dna的扩增及镰刀状红细胞贫血病的产前诊断。自85年首ci报道pcr方法以来，pcr被广泛应用于分子克隆、序列分析、基因突变、遗传病、传染病、性传播性疾病及法医判定和考古研究等多领域、并发挥了越来越大的作用。因而发明人kary b、mulis获1993年诺贝尔化学奖。
为了使pcr技术在临床上迅速得以普及，我们对该技术的某些程序成功地作了重大改革，使pcr技术变得简单、微量化、不易发生污染，从而使pcr技术常规化成为可能。我们的方法迅速在全国各大医院得到推广。
一、pcr的基本原理和基本程序
pcr扩增dna的原理是：先将含有所需扩增分析序列的靶dna双链经热变性处理解开为两个寡聚核苷酸单链，然后加入一对根据已知dna序列由人工合成的与所扩增的dna两端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段作为引物，即左右引物。此引物范围就在包括所欲扩增的dna片段，一般需20-30个碱基对，过少则难保持与dna单链的结合。引物与互补dna结合后，以靶dna单链为模板，经反链杂交复性（退火），在taqdna聚合酶的作用下以4种三磷酸脱氧核苷（dntp）为原料按5'到3'方向将引物延伸、自动合成新的dna链、使dna重新复制成双链。然后又开始第二次循环扩增。引物在反应中不仅起引导作用，而且起着特异性的限制扩增dna片段范围大小的作用。新合成的dna链含有引物的互补序列，并又可作为下一轮聚合反应的模板。如此重复上述dna模板加热变性双链解开—引物退火复性—在dna聚合酶作用下的引物延伸的循环过程，使每次循环延伸的模板又增加1倍，亦即扩增dna产物增加1倍，经反复循环，使靶dna片段指数性扩增。
pcr的扩增倍数y=（1+e）n,这里y是扩增量，n为pcr的循环次数。e为pcr循环扩增效率。设pcr扩增效率e为100%、循环次数n=25次，靶dna将扩增到33554432个拷贝，即扩增3355万倍：若e为80%、n=20、则扩增数量将下降到1408865拷贝，即扩增产物约丢失93%，若e=100%，n=20，则扩增数量减少1048576个拷贝，扩增产物约减少97%。可见pcr循环扩增效率及循环次数都对扩增数量有很大影响。pcr扩增属于酶促反应，所以，dna扩增过程遵循酶促动力学原理。靶dna片段的扩增最初表现为直线上升，随着靶dna片段的逐渐积累，当引物—模板/dna/聚合酶达到一定比值时，酶的促化反应趋于饱和，此时靶dna产物的浓度不再增加，即出现所谓平台效应。pcr反应达到平台期的时间主要取决于反应开始时样品中的靶dna的含量和扩增效率，起始模板量越多到达平台期的时间就越短、扩增效率越高到达平台期的时间也越短。另外酶的含量，dntp 浓度，非特异性产物的扩增都对到达平台期时间有影响。
二、pcr的特点
（一）特异性高：shou次报导的pcr所用的dna聚合酶是大肠杆菌的dnapolymerasei的klenow大片段，其酶活性在90℃会变性失活，需每次pcr循环都要重新加入klenow大片段，同时引物是在37℃延伸（聚合）易产生模板—引物之间的碱基错配、致特异性较差，1988年saiki等从温泉水中分离到的水生嗜热杆菌中提取的热稳定的taqdna聚合酶，在热变性处理时不被灭活，不必在每次循环扩增中再加入新酶，可以在较高温度下连续反应，显著地提高pcr产物的特异性，序列分析证明其扩增的dna序列与原模板dna一致。扩增过程中，单核苷酸的错误参入程度很低、其错配率一般只有约万分之一，足可以提供特异性分析，选用各型病毒相对的特异寡核苷酸引物。pcr能一次确定病毒的多重感染。如用hpv11和hpv16型病毒引物检测病妇宫颈刮片细胞可以发现部分病人存在hpv11和hpv16两型的双重感染。
（二）高度敏感：理论上pcr可以按2n倍数扩增dna十亿倍以上，实际应用已证实可以将极微量的靶dna成百万倍以上地扩增到足够检测分析量的dna。能从100万个细胞中检出一个靶细胞，或对诸如病人口液等只含一个感染细胞的标本或仅含0.01pg的感染细胞的特异性片段样品中均可检测。
（三）快速及无放射性：一般在2小时内约可完成30次以上的循环扩增，加上用电泳分析。只需3-4小时便可完成，不用分离提纯病毒，dna粗制品及总rna均可作为反应起始物，可直接用临床标本如血液、体液、尿液、洗液、脱落毛发、细胞、活体组织等粗制的dna的提取液来扩增检测，省去费时繁杂的提纯程序，扩增产物用一般电泳分析即可，不一定用同位素，无放射性易于推广。
（四）简便：扩增产物可直接供作序列分析和分子克隆，摆脱繁琐的基因方法，可直接从rna或染色体dna中或部分dna已降解的样品中分离目的基因，省去常规方法中须先进行克隆后再作序列分析的冗繁程序。已固定的和包埋的组织或切片亦可检测。如在pcr引物端事先构建一个内切酶位点，扩增的靶dna可直接克隆到m13，puc19等相应酶切位点的载体中。
（五）可扩增rna或cdna：先按通常方法用寡脱氧胸苷引物和逆转录酶将mrna转变成单链cdna，再将得到的单链cdna进行pcr扩增，即使mrna转录片段只有100ngcdna中的0.01%，也能经pcr扩增1ng有242碱基对长度的特异片段，有些外显子分散在一段很长的dna中，难以将整段dna大分子扩增和做序列分析。若以mrna作模板，则可将外显子集中，用pcr一次便完成对外显子的扩增并进行序列分析。
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为了使pcr技术在临床上迅速得以普及，我们对该技术的某些程序成功地作了重大改革，使pcr技术变得简单、微量化、不易发生污染，从而使pcr技术常规化成为可能。我们的方法迅速在全国各大医院得到推广。
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pcr扩增dna的原理是：先将含有所需扩增分析序列的靶dna双链经热变性处理解开为两个寡聚核苷酸单链，然后加入一对根据已知dna序列由人工合成的与所扩增的dna两端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段作为引物，即左右引物。此引物范围就在包括所欲扩增的dna片段，一般需20-30个碱基对，过少则难保持与dna单链的结合。引物与互补dna结合后，以靶dna单链为模板，经反链杂交复性（退火），在taqdna聚合酶的作用下以4种三磷酸脱氧核苷（dntp）为原料按5'到3'方向将引物延伸、自动合成新的dna链、使dna重新复制成双链。然后又开始第二次循环扩增。引物在反应中不仅起引导作用，而且起着特异性的限制扩增dna片段范围大小的作用。新合成的dna链含有引物的互补序列，并又可作为下一轮聚合反应的模板。如此重复上述dna模板加热变性双链解开—引物退火复性—在dna聚合酶作用下的引物延伸的循环过程，使每次循环延伸的模板又增加1倍，亦即扩增dna产物增加1倍，经反复循环，使靶dna片段指数性扩增。
pcr的扩增倍数y=（1+e）n,这里y是扩增量，n为pcr的循环次数。e为pcr循环扩增效率。设pcr扩增效率e为100%、循环次数n=25次，靶dna将扩增到33554432个拷贝，即扩增3355万倍：若e为80%、n=20、则扩增数量将下降到1408865拷贝，即扩增产物约丢失93%，若e=100%，n=20，则扩增数量减少1048576个拷贝，扩增产物约减少97%。可见pcr循环扩增效率及循环次数都对扩增数量有很大影响。pcr扩增属于酶促反应，所以，dna扩增过程遵循酶促动力学原理。靶dna片段的扩增最初表现为直线上升，随着靶dna片段的逐渐积累，当引物—模板/dna/聚合酶达到一定比值时，酶的促化反应趋于饱和，此时靶dna产物的浓度不再增加，即出现所谓平台效应。pcr反应达到平台期的时间主要取决于反应开始时样品中的靶dna的含量和扩增效率，起始模板量越多到达平台期的时间就越短、扩增效率越高到达平台期的时间也越短。另外酶的含量，dntp 浓度，非特异性产物的扩增都对到达平台期时间有影响。
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（一）特异性高：shou次报导的pcr所用的dna聚合酶是大肠杆菌的dnapolymerasei的klenow大片段，其酶活性在90℃会变性失活，需每次pcr循环都要重新加入klenow大片段，同时引物是在37℃延伸（聚合）易产生模板—引物之间的碱基错配、致特异性较差，1988年saiki等从温泉水中分离到的水生嗜热杆菌中提取的热稳定的taqdna聚合酶，在热变性处理时不被灭活，不必在每次循环扩增中再加入新酶，可以在较高温度下连续反应，显著地提高pcr产物的特异性，序列分析证明其扩增的dna序列与原模板dna一致。扩增过程中，单核苷酸的错误参入程度很低、其错配率一般只有约万分之一，足可以提供特异性分析，选用各型病毒相对的特异寡核苷酸引物。pcr能一次确定病毒的多重感染。如用hpv11和hpv16型病毒引物检测病妇宫颈刮片细胞可以发现部分病人存在hpv11和hpv16两型的双重感染。
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