大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法
大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法
关于感受态细胞(competent cells)
常态的细胞不能摄入外部溶液中的dna，，所以要转化质粒 dna 进入大肠杆菌必须首先
制备感受态的大肠杆菌细胞。受体细胞经过一些特殊方法(如：cacl，rucl 等化学试剂法)
的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源 dna 的载体分子通过的感受态细
胞(competentcell) 。
转化，是将异源 dna 分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，
是基因工程等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的 dna分子通过复制表达，才能实现遗
传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制-修饰
系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
α-互补现象：因为许多载体都带有一个 lacz 基因的调控序列和头 146 个氨基酸的编码
信息，编码 α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型 β-半乳糖苷酶实现基因内互补( α-
互补)。当这种载体转入可编码?-半乳糖苷酶 c端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-?-d
硫代半乳糖苷(iptg)的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，
但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为 α-互补现象。由互补产
生的 α-半乳糖苷酶(lacz)能够作用于生色底物 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖
苷(x-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入
一个多克隆位点，当插入一个外源 dna 段时，会造成 lacz(α)基因的失活，破坏 α-互补
作用，就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落
为蓝色。
大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法
方法一：
细菌转化的方法多以mendel和higa(1970)的发现为基础，其基本方法是用冰预冷的
cacl 或多种 2 价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化。
2
用cacl2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞，常用于成批制备感受态细菌。本法适
用于大多数大肠杆菌菌株，且迅速、重复性好。操作过程简述如下。
1.从 37℃培养16～20h 的新鲜平板中挑取一个单菌落(如大肠杆菌 dh52)，或 1ml
新鲜的 16～20h 过夜培养物，转到一个含有 100mllb培养基的1l或 500ml烧瓶中。于 37℃
剧烈振摇培养约 2～3h(旋转摇床 200～300r/min)，每隔 20～30min 测量 od600 值≈0.4。
2.在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的 50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置
10～20min。
3.于 4℃用 sorvallgs2 转头(或与其离心管相配的转头)以 4000r/min 离心 10min，
以回收细胞。
4.倒数培养液，将管倒置 1min以使后残留的痕量培养液流尽。
5.以 10ml用冰预冷的 0.1mmcacl2重悬每份沉淀，放于冰上。
6.于 4℃用 sorvallgs3 转头(或与其相应的转头)以 4000r/min 离心10min，以回收
细胞。
7.倒出培养液，将管倒置 1min以使后残留的痕量培养液流尽。
8.每 50ml初始培养物用 2ml冰预冷的 0.1m cacl2重悬每份沉定，此时，可以迅速将细
胞分装成小份，液氮中冰冻，-70℃贮存备用。
9.用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取 200μl 转移到无菌的微量离心管
中，每管加 dna 或连接反应混合物(体积≤10μl，dna≤50ng)，轻轻旋转以混匀内容物，
在冰中放置 30min。
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互补)。当这种载体转入可编码?-半乳糖苷酶 c端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-?-d
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但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为 α-互补现象。由互补产
生的 α-半乳糖苷酶(lacz)能够作用于生色底物 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖
苷(x-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入
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作用，就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落
为蓝色。
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方法一：
细菌转化的方法多以mendel和higa(1970)的发现为基础，其基本方法是用冰预冷的
cacl 或多种 2 价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化。
2
用cacl2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞，常用于成批制备感受态细菌。本法适
用于大多数大肠杆菌菌株，且迅速、重复性好。操作过程简述如下。
1.从 37℃培养16～20h 的新鲜平板中挑取一个单菌落(如大肠杆菌 dh52)，或 1ml
新鲜的 16～20h 过夜培养物，转到一个含有 100mllb培养基的1l或 500ml烧瓶中。于 37℃
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10～20min。
3.于 4℃用 sorvallgs2 转头(或与其离心管相配的转头)以 4000r/min 离心 10min，
以回收细胞。
4.倒数培养液，将管倒置 1min以使后残留的痕量培养液流尽。
5.以 10ml用冰预冷的 0.1mmcacl2重悬每份沉淀，放于冰上。
6.于 4℃用 sorvallgs3 转头(或与其相应的转头)以 4000r/min 离心10min，以回收
细胞。
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