饲料中黄霉素的测定高效液相色谱法
摘要：黄霉素为磷酸化多糖类***，其**作用机理是通过干扰细胞壁的结构物质肽聚糖的生物合成从而抑制**的繁殖。黄霉素的促生长原理可能在于它能提高饲料中能量和蛋白质的消化；能使肠壁变薄从而提高营养物质的吸收；能有效地维持肠道菌群的平衡和瘤胃ph值的稳定。
1简介
饲料中黄霉素检验的高效液相色谱法测定方法。
本标准适用于饲料中黄霉素的测定，使用仪器501高效液相色谱仪。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其*新版本（包括所有适用于本文件。
gb/t6682分析实验室用水规格和试验方法
gb/t14699.1饲料采样
3试样制备
按gb/t14699.1抽取有代表性的饲料样品，用四分法缩减取约200g，粉碎至过0.45mm孔径
的分析筛，混匀，装入磨口瓶中备用。
4原理
饲料中黄霉素经50％的甲醇提取后，用ph6.0磷酸盐缓冲液稀释至所需浓度，反相色谱柱进行分离，uv501紫外检测器检测，外标法定量。
5试剂和溶液
5.1除非另有说明，本法所用试剂均为分析纯，水为符合gb/t6682二级水的规定。
5.2黄霉素对照品：纯度。
5.3黄霉素储备液：精密称取黄霉素对照品适量，用甲醇配制成1mg/ml，作为标准储备溶（贮存4℃冰箱保存10天）。
5.4黄霉素标准工作液：量取适量黄霉素储备液，用ph6.0磷酸盐缓冲液稀释成浓度为0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.50μg/ml的系列标准工作液（4℃保存7天）。
5.5甲醇：色谱纯。
5.6乙腈：色谱纯。
5.7甲酸加水使溶解成1000ml，即得。
6仪器设备
6.1501高效液相色谱仪（配uv501紫外检测器）。
6.2饲料粉碎机。
6.3分析天平，感量0.0001g，0.001g。
7测定步骤
7.1试样提取
称取粉碎后的饲料样品5g（**至0.001g），加入50.0ml50％甲醇溶液提取后，过滤，滤
液用磷酸盐缓冲液ph6.0稀释至所需的适当浓度，经0.45μm滤膜过滤后供高效液相色谱仪分析。
7.2色谱条件
色谱柱：vertcec18柱（4.6×150mm，5μm）或性能相当的色谱柱。
流速：0.7ml/min。
检测波长：258nm。
进样量：20μl。
流动相：乙腈:0.2％甲酸铵水溶液=45:55（用10％磷酸调节至ph4.9）
7.3上机测定
取标准工作液和样品试液分别注入液相色谱仪，记录谱图，按外标法以峰面积进行计算。
8结果计算
按照下式计算试样中**的含量：
x=a×cs×v×1000/as×m×1000×n
式中：
x——试样中**的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
a——应的色谱峰面积响应值；
as——标准溶液对应的色谱峰面积响应值；
v——定容体积，单位为毫升（ml）；
cs——标准溶液的浓度，单位为微克每毫升（μg/ml）；
m——试样质量，单位为克（g）；
n——稀释倍数。
平行测定结果用算术平均值表示，结果保留3位有效数字。
9检测方法灵敏度、准确度、精密度
9.1灵敏度
本方法的检测限为0.5mg/kg。
9.2准确度
本方法添加浓度1.0mg/kg，回收率为80％～120％。9.3
精密度
本方法的批内变异系数cv≤10％，批间变异系数cv≤15％。
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4原理
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5试剂和溶液
5.1除非另有说明，本法所用试剂均为分析纯，水为符合gb/t6682二级水的规定。
5.2黄霉素对照品：纯度。
5.3黄霉素储备液：精密称取黄霉素对照品适量，用甲醇配制成1mg/ml，作为标准储备溶（贮存4℃冰箱保存10天）。
5.4黄霉素标准工作液：量取适量黄霉素储备液，用ph6.0磷酸盐缓冲液稀释成浓度为0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.50μg/ml的系列标准工作液（4℃保存7天）。
5.5甲醇：色谱纯。
5.6乙腈：色谱纯。
5.7甲酸加水使溶解成1000ml，即得。
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7测定步骤
7.1试样提取
称取粉碎后的饲料样品5g（**至0.001g），加入50.0ml50％甲醇溶液提取后，过滤，滤
液用磷酸盐缓冲液ph6.0稀释至所需的适当浓度，经0.45μm滤膜过滤后供高效液相色谱仪分析。
7.2色谱条件
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式中：
x——试样中**的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
a——应的色谱峰面积响应值；
as——标准溶液对应的色谱峰面积响应值；
v——定容体积，单位为毫升（ml）；
cs——标准溶液的浓度，单位为微克每毫升（μg/ml）；
m——试样质量，单位为克（g）；
n——稀释倍数。
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