内毒素专题|内毒素检测总出现假阴性？掌握这些才能应万变
在生物制品、医疗器械等产品的整个生产阶段，无论是原辅料、过程产品的过程检测还是终产品的放行检测中，细菌内毒素检测（bet）都是需要的环节，如果内毒素检测出现假阴性，那么有潜在内毒素的产品有可能被放行到市场中，引起发热、休克甚至更重大的事故。
小伙伴们是不是也经常被假阴性折磨呢，本期小编带你了解如何应对bet假阴性！
什么是假阴性
对于凝胶法，当供试品内毒素浓度≥2倍检测试剂的灵敏度，但检测结果仍为阴性，则说明bet假阴性。对于光度法，若内毒素的回收率＜50%，则说明在此试验条件下供试品溶液存在抑制干扰，导致内毒素检测不出来。
造成假阴性的干扰因素及解决方案
供试品的干扰
ph值
bet机理是酶促反应，而酶的反应条件相对来讲比较严苛，因此要求供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的ph值在6.0～8.0的范围内，过高或过低的ph都会抑制反应，出现假阳性。
若不在6.0～8.0范围，建议使用厂家提供的缓冲buffer稀释调节，如tris buffer。
二价阳离子
内毒素激活鲎试剂中的酶需要二价阳离子，如mg2+的参与，若供试样品中存在的肝素或edta等成分螯合阳离子，二价阳离子浓度不足时，便抑制反应，导致假阴性的出现。为了克服金属离子螯合剂的抑制干扰，可用mgcl2稀释供试品。
与mg2+不同，ca2+不会激活bet反应，而是具有非常强烈的抑制作用，因此存在ca2+的供试品可用lrw稀释。
高渗透压
过高浓度的盐或糖溶液会脱去蛋白质中的水分子，使蛋白质变性，出现抑制干扰。可通过稀释供试品去除干扰。
酶抑制剂
人血浆中的丝氨酸蛋白酶抑制剂会抑制内毒素激活鲎试剂。可用lrw稀释10倍，再70±2℃加热10 min破坏抑制剂，进而去除干扰。
屏蔽内毒素
血浆蛋白组分、电解质溶液和脂质乳剂等有结合内毒素的特性，如脂质乳剂的两亲性对疏水的内毒素具有亲和力，脂类包裹内毒素，使内毒素无法暴露出来，实验结果将出现假阴性。可通过添加分散剂的方式去除抑制干扰。
操作（包括操作环境）
操作
鲎试剂与细菌内毒素反应后形成的凝胶比较脆弱，容易受到震动等剧烈操作而变形，将检测结果误判为阴性。
因此对于凝胶法，在温育过程和取放反应管时一定要轻柔操作，避免安瓶或试管左右晃动，且在保温过程中不可随时取出观察。
反应温度
鲎试剂的灵敏度对温度较敏感，反应温度在25~40℃之间，一般设置37°c ± 1°c。温度过高，会破坏鲎试剂，从而达不到检测目的。
实验耗材、器具
检测器具
在稀释标准品等操作过程中要用到一些器具，建议选择玻璃器材，非塑料制品，因为塑料制品容易吸附内毒素，造成bet反应内毒素不足。
表面活性剂
高浓度表面活性剂会使鲎试剂中的蛋白质变性，形成抑制。因此所用器具在用洗涤剂清洗后要冲洗干净并灭菌，供试品溶液可通过lrw稀释来降低干扰。
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若不在6.0～8.0范围，建议使用厂家提供的缓冲buffer稀释调节，如tris buffer。
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与mg2+不同，ca2+不会激活bet反应，而是具有非常强烈的抑制作用，因此存在ca2+的供试品可用lrw稀释。
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操作
鲎试剂与细菌内毒素反应后形成的凝胶比较脆弱，容易受到震动等剧烈操作而变形，将检测结果误判为阴性。
因此对于凝胶法，在温育过程和取放反应管时一定要轻柔操作，避免安瓶或试管左右晃动，且在保温过程中不可随时取出观察。
反应温度
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实验耗材、器具
检测器具
在稀释标准品等操作过程中要用到一些器具，建议选择玻璃器材，非塑料制品，因为塑料制品容易吸附内毒素，造成bet反应内毒素不足。
表面活性剂
高浓度表面活性剂会使鲎试剂中的蛋白质变性，形成抑制。因此所用器具在用洗涤剂清洗后要冲洗干净并灭菌，供试品溶液可通过lrw稀释来降低干扰。
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