哪些因素决定了PCR反应的特异性
pcr反应的特异性决定因素为：①引物与模板dna特异正确的结合；
②碱基配对原则；
③taq dna聚合酶合成反应的忠实性；
④靶基因的特异性与保守性。
pcr实验方法步骤：
方法
1：在冰浴中，产品仅用于科研按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×pcr buffer
5μl dntp mix （2mm）
4μl 引物1（10pm）
2μl 引物2（10pm）
2μl taq酶 （2u/μl）
1μl dna模板（50ng-1μg/μl）
1μl 加ddh2o至 50 μl
视pcr仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2：调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置pcr仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，在72℃ 保7min。
3：伴放线放线杆菌探针法荧光定量pcr试剂盒结束反应，pcr产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4：pcr的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μl进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
注意事项:
1.pcr反应应该在一个没有dna污染的干净环境中进行，设立一个的pcr实验室。
2.纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
3.所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染，产品仅用于科研操作过程中均应戴手套。
4.pcr试剂配制应使用高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。
5.试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。
6.试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。
7.pcr的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。
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②碱基配对原则；
③taq dna聚合酶合成反应的忠实性；
④靶基因的特异性与保守性。
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方法
1：在冰浴中，产品仅用于科研按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
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2μl 引物2（10pm）
2μl taq酶 （2u/μl）
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1μl 加ddh2o至 50 μl
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2：调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置pcr仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，在72℃ 保7min。
3：伴放线放线杆菌探针法荧光定量pcr试剂盒结束反应，pcr产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4：pcr的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μl进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
注意事项:
1.pcr反应应该在一个没有dna污染的干净环境中进行，设立一个的pcr实验室。
2.纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
3.所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染，产品仅用于科研操作过程中均应戴手套。
4.pcr试剂配制应使用高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。
5.试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。
6.试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。
7.pcr的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。
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