液相色谱系统分析初榨橄榄油中的生育酚和生育三烯酚
本应用简报中展示了利用带荧光检测的 agilent 1260 infinity 生物惰性四元液相色谱系统对初榨橄榄油中的生育酚和生育三烯酚进行正相色谱分析。结果显示，与标准的不 锈钢系统相比，使用生物惰性系统可大大改善保留时间及峰面积的精度。所有八种维 生素 e 异构体均具有*的线性，且检测限 (lod) 和定量限 (loq) 均在低 µg/ml 范围 内。九个橄榄油样品的分析结果表明：橄榄油中 a-生育酚的含量为 100 至 390 mg/kg。 且检测发现，不*精制和初榨橄榄油中的维生素 e 含量相同。
初榨橄榄油来自橄榄树 (olea europea l.) 的果实，加工过程仅使用机械压榨，不采 用任何热或化学处理。为确保初榨橄榄油 产品的真实性，包括无掺假、错贴标签、 描述错误或产地误导，过去二十年里已建 立有大量用于评估植物油的方法1。其中 对于热处理橄榄油的分析，在之前的应用 简报中已有详细介绍2,3,4 。
营养学优势方面，初榨橄榄油是许多生物 活性成分的来源，这些成分对人体健 康有较高的化学保护作用。除了高含量的 单不饱和及多不饱和脂肪酸之外，它还含 有价值*的抗氧化成分，如植物甾醇、 类胡萝卜素、酚类和维生素 e5,6 。这些生 物活性成分的含量与基因、栽培和环境因 素相关。“维生素 e”这个名称包含四种生 育酚（a-、b-、g- 和 d-生育酚）和四种 生育三烯酚（a-、b-、g- 和 d-三烯生育 酚）异构体。所有这八种形式均包含一个 色原烷醇环和一个异戊二烯基，生育三烯 酚中具有 3 个双键，见图 1。在初榨橄榄 油中，生育酚/生育三烯酚总含量的 95% 是 a-生育酚6 。
由于维生素 e 的生物活性具有多样性，且 与大多数单体生育酚和生育三烯酚在癌症 或梗塞预防中的作用相关，因此有必要对 维生素 e 进行全面的谱图分析6。采用合 适的色谱技术对所有维生素 e 异构体进行 分离、鉴定和定量是对维生素 e 进行全面 谱图分析的重要因素。反相 (rp) 和正相 (np) 高压液相色谱 (hplc) 均可用于分析 生育酚和生育三烯酚。本应用简报中采用 了正相超高压液相色谱 (uhplc)，此系统 可实现所有维生素 e 异构体的良好分离6 。 维生素 e 异构体的荧光性质使其可通过灵 敏的荧光检测技术进行检测。
已知生育酚非常敏感，常会发生降解，产 物包括（例如）生育酚红、生育酚紫、 对生育酚、醌和二聚反应产物7。特别是 在光致氧化作用下会发生降解过程，同 时在 fe3+ 或 cu2+ 离子存在时的氧化作用 下也会发生降解7。由于后者的原因，在 不锈钢 hplc/uhplc 体系中进行的液相 色谱分析常会得出非常差的保留时间和峰 面积精度。为比较保留时间 (rt) 和峰面 积的重现性，本应用简报中同时采用不 锈钢（agilent 1260 infinity 四元液相色 谱系统）和生物惰性系统（agilent 1260 infinity 生物惰性四元液相色谱系统）进行 分析。
实验部分 agilent 1260 infinity 生物惰性四元液相色 谱系统，包括以下模块： • agilent 1260 infinity 生物惰性四元泵 (g5611a) • agilent 1260 infinity 生物惰性自 动进样器 (g5667a) • agilent 1290 infinity 柱温箱 (g1330b)， 用于样品冷却 • agilent 1290 infinity 柱温箱 (g1316c)， 配置生物惰性溶剂热交换器 • agilent 1260 infinity 荧光检测器 (g1321b)，配置生物惰性标准 fld 流通池 agilent 1260 infinity 四元液相色谱系统， 包括以下模块： • agilent 1260 infinity 四元泵 (g1311b) • agilent 1260 infinity 自动进样器 (g1367e) • agilent 1290 infinity 柱温箱 (g1330b)， 用于样品冷却 • agilent 1290 柱温箱 (g1316c) • agilent 1260 infinity 荧光检测器 (g1321b)，配置标准 fld 流通池要在 1260 infinity 四元液相色谱系统（不 锈钢和生物惰性）中执行正相色谱分析， 清洗和柱塞杆密封垫必须从反相（标配） 更换为正相部件： • 柱塞杆密封垫 - 正相（部件号 0905- 1420） • 清洗密封垫 (pe)（部件号 0905-1718）
样品 生育酚和生育三烯酚混合溶液标准品（溶 于庚烷）购自 lgc 标准品公司（特丁顿， 英国）。一系列橄榄油（初榨及不*精制 橄榄油）购自本地商店。对于正相分析， 橄榄油样品采用庚烷稀释至 100 mg/ml 的 浓度，然后注射入 uhplc 系统进行分析。溶剂 正庚烷及甲基叔丁基醚 (tbme)均为 lc级， 购自西格玛奥德里奇公司（圣路易斯，密 苏里州，美国）。 色谱柱 agilent lichrospher diol 色谱柱， 4 × 250 mm，5 µm（部件号 79925di-584） 软件 agilent openlab cds chemstation 版， 适用于 lc 和 lc/ms 系统，修订版 c.01. 04 [35]
结果与讨论 图 2 中展示了采用正相色谱法成功分离生 育酚和生育三烯酚标准品（来自 lgc 标 准品公司）中的所有维生素 e 异构体的色 谱图。实验同时测定了两种系统（1260 infinity 四元液相色谱系统及 1260 infinity 生物惰性四元液相色谱系统）中保留时间 和峰面积的精度。图 2 所示为生物惰性系 统中六次分析的叠加图，其中的保留时间 和峰面积均具有出色的相对标准偏差。 表 2 总结了两种系统中维生素 e 异构体分 析的结果。在生物惰性系统中，保留时间 精度和峰面积结果更为优异，这是由于存 在 fe3+ 离子时异构体会经历氧化过程7 。 对于保留时间精度，生物惰性系统可表 现出高达十倍的性能提高，例如 a-生育 酚在该系统下的保留时间精度值 rsd 低 于 0.07%，而在不锈钢系统中的 rsd 为 0.68%。同时，使用生物惰性系统时，峰 面积的精度也可提高三至十倍（a-生育酚 为四倍）。
为测定线性、lod 及 loq，使用正庚烷以 1所有的维生素 e 异构体均具有*的线 性，相关系数均大于 0.9998。lod 及 loq 均在低 µg/ml 范围内，例如在橄榄油中， 少量的 b-生育酚及 b-生育三烯酚也可被 检测出。比例逐级稀释生育酚和生育三烯酚 标准品溶液，见表 3。实验准备了八个不同浓度的系列标准品溶 液，然后计算峰面积和对应浓度之间的线 性关系。lod 及 loq 分别定义为信噪比 3:1 及 10:1 时的浓度。表 4 列出了所有维 生素 e 异构体的线性、lod 及 loq 结果。
图 3 中展示了初榨橄榄油中维生素 e 异构 体的组成分析。与文献报道类似6，初榨 橄榄油中总维生素 e 异构体含量的 95% 为 a-生育酚。此外，还可检测到少量的 g-生 育酚，b-生育酚及 b-生育三烯酚。 实验共检测了九种橄榄油样品中的维生素 e 含量，见表 5。所测定维生素 e 异构体： a-、b-、g 生育酚及 b-生育三烯酚的含 量与文献中描述的含量一致，例如，a-生 育酚的含量约为每千克橄榄油中含 100 至 390 mg6,8 。不*精制（样品 3）和初榨 橄榄油（样品 1，2 和 4 - 8）在维生素 e 含量方面没有任何差异。
结论 存在 fe3+ 或 cu2+ 离子时，生育酚会因氧 化作用而发生降解7。因此，在分析生育 酚和生育三烯酚时，若想获得高精度的 保留时间和峰面积，我们强烈建议使用 agilent 1260 infinity 生物惰性四元液相色谱系统。此生物惰性系统可将保留时间的 精度提高多达十倍，此外，生物惰性系统 还可改善约十倍的峰面积精度。 将采用庚烷的正相色谱法与生物惰性系统 联用，八种维生素 e 异构体均可获得* 的线性，并且 lod 及 loq 值均在低 µg/ml 范围内。所测九种橄榄油样品中的生育 酚/生育三烯酚含量为 100 至 390 mg/kg 橄榄油（以 a-生育酚为例）。不*精制 和初榨橄榄油中维生素 e 的含量无差异。
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初榨橄榄油来自橄榄树 (olea europea l.) 的果实，加工过程仅使用机械压榨，不采 用任何热或化学处理。为确保初榨橄榄油 产品的真实性，包括无掺假、错贴标签、 描述错误或产地误导，过去二十年里已建 立有大量用于评估植物油的方法1。其中 对于热处理橄榄油的分析，在之前的应用 简报中已有详细介绍2,3,4 。
营养学优势方面，初榨橄榄油是许多生物 活性成分的来源，这些成分对人体健 康有较高的化学保护作用。除了高含量的 单不饱和及多不饱和脂肪酸之外，它还含 有价值*的抗氧化成分，如植物甾醇、 类胡萝卜素、酚类和维生素 e5,6 。这些生 物活性成分的含量与基因、栽培和环境因 素相关。“维生素 e”这个名称包含四种生 育酚（a-、b-、g- 和 d-生育酚）和四种 生育三烯酚（a-、b-、g- 和 d-三烯生育 酚）异构体。所有这八种形式均包含一个 色原烷醇环和一个异戊二烯基，生育三烯 酚中具有 3 个双键，见图 1。在初榨橄榄 油中，生育酚/生育三烯酚总含量的 95% 是 a-生育酚6 。
由于维生素 e 的生物活性具有多样性，且 与大多数单体生育酚和生育三烯酚在癌症 或梗塞预防中的作用相关，因此有必要对 维生素 e 进行全面的谱图分析6。采用合 适的色谱技术对所有维生素 e 异构体进行 分离、鉴定和定量是对维生素 e 进行全面 谱图分析的重要因素。反相 (rp) 和正相 (np) 高压液相色谱 (hplc) 均可用于分析 生育酚和生育三烯酚。本应用简报中采用 了正相超高压液相色谱 (uhplc)，此系统 可实现所有维生素 e 异构体的良好分离6 。 维生素 e 异构体的荧光性质使其可通过灵 敏的荧光检测技术进行检测。
已知生育酚非常敏感，常会发生降解，产 物包括（例如）生育酚红、生育酚紫、 对生育酚、醌和二聚反应产物7。特别是 在光致氧化作用下会发生降解过程，同 时在 fe3+ 或 cu2+ 离子存在时的氧化作用 下也会发生降解7。由于后者的原因，在 不锈钢 hplc/uhplc 体系中进行的液相 色谱分析常会得出非常差的保留时间和峰 面积精度。为比较保留时间 (rt) 和峰面 积的重现性，本应用简报中同时采用不 锈钢（agilent 1260 infinity 四元液相色 谱系统）和生物惰性系统（agilent 1260 infinity 生物惰性四元液相色谱系统）进行 分析。
实验部分 agilent 1260 infinity 生物惰性四元液相色 谱系统，包括以下模块： • agilent 1260 infinity 生物惰性四元泵 (g5611a) • agilent 1260 infinity 生物惰性自 动进样器 (g5667a) • agilent 1290 infinity 柱温箱 (g1330b)， 用于样品冷却 • agilent 1290 infinity 柱温箱 (g1316c)， 配置生物惰性溶剂热交换器 • agilent 1260 infinity 荧光检测器 (g1321b)，配置生物惰性标准 fld 流通池 agilent 1260 infinity 四元液相色谱系统， 包括以下模块： • agilent 1260 infinity 四元泵 (g1311b) • agilent 1260 infinity 自动进样器 (g1367e) • agilent 1290 infinity 柱温箱 (g1330b)， 用于样品冷却 • agilent 1290 柱温箱 (g1316c) • agilent 1260 infinity 荧光检测器 (g1321b)，配置标准 fld 流通池要在 1260 infinity 四元液相色谱系统（不 锈钢和生物惰性）中执行正相色谱分析， 清洗和柱塞杆密封垫必须从反相（标配） 更换为正相部件： • 柱塞杆密封垫 - 正相（部件号 0905- 1420） • 清洗密封垫 (pe)（部件号 0905-1718）
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图 3 中展示了初榨橄榄油中维生素 e 异构 体的组成分析。与文献报道类似6，初榨 橄榄油中总维生素 e 异构体含量的 95% 为 a-生育酚。此外，还可检测到少量的 g-生 育酚，b-生育酚及 b-生育三烯酚。 实验共检测了九种橄榄油样品中的维生素 e 含量，见表 5。所测定维生素 e 异构体： a-、b-、g 生育酚及 b-生育三烯酚的含 量与文献中描述的含量一致，例如，a-生 育酚的含量约为每千克橄榄油中含 100 至 390 mg6,8 。不*精制（样品 3）和初榨 橄榄油（样品 1，2 和 4 - 8）在维生素 e 含量方面没有任何差异。
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