细胞培养实战指南：如何做好细胞实验？
细胞是生物体的基本结构和功能单位。
细胞培养是在人工环境下，将细胞种植或培养在培养皿或培养瓶中，提供适当的培养基和条件，使细胞能够在体外持续生长和繁殖的过程。
细胞培养实验中，有一些细节，对于高效地完成实验十分重要。本期内
容，盘点细胞实验“实战”过程中的关键点。
实验前准备
1、明确细胞身份
在实验正式开始前，需要根据实验目的，确定所需的细胞系。不同的细胞系在形态、生理、代谢和功能等方面有很大的差异。选择适合研究目的的细胞系可以增加实验的准确性和可靠性。
选择来源靠谱的细胞系（细胞类型、细胞来源、细胞代数等信息），根据不同细胞来源，寻找相应的细胞培养资料，明确培养基种类、培养物添加量、培养条件（温度、湿度、二氧化碳浓度）等。
2、实验室环境清洁
在细胞实验开始前，需要对细胞培养环境进行清洁消毒甚至是灭菌处理。仪器、培养室墙壁与地面、培养室空间都应采取对应的清洁措施。
3、准备实验材料
选择高品质的实验耗材与试剂，尽可能选择无菌化处理过后的，若非无菌级，则需自行灭菌后才可用于细胞培养。
胎牛血清是许多细胞培养实验中一种重要的添加物。提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。还能够提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调节它们所结合的物质活力。
ausbian进口特级胎牛血清，精选内毒素更低批次（≤3eu/ml），澳洲血源，是细胞典藏等重大项目十几年的稳定供应品牌。新批次在试用前，提供试用服务，养细胞更放心。全程冷链运输，减少反复冻融对胎牛血清品质的影响。
实验过程
细胞复苏
——液氮中取出的细胞，待液氮挥发后，马上将细胞冻存管置于37℃水浴中轻轻摇动使快速融化（尽量控制在2min内，时间过长了可能会影响细胞的状态）。在解冻时，冻存管瓶口尽量控制在水面以上。
——解冻后，将冻存管转移到无菌操作台，75%酒精擦拭冻存管外部。
——将细胞悬液转移至，装有37℃预热的培养基离心管中，800-1000rpm离心3-5分钟，弃上清。
——重新加入经预热培养基重悬细胞，以适宜密度，一般约为(3~5)×10^5个/ml密度接种到培养器皿（直径10cm）中。放到37℃孵育，第二天显微镜下观察细胞的情况。
细胞传代
——用移液器吸取并丢弃使用过的细胞培养基（不要直接倒掉，避免瓶口残留导致易污染），并用pbs缓慢冲洗细胞2次。
——以直径10cm的培养皿为例，向培养皿中加入500μl胰蛋白酶-edta（根据各细胞的使用说明，选择合适的浓度）消化液，轻轻摇动培养皿，使消化液流遍所有细胞表面，放到37℃孵育（一般2分钟左右即可）。镜下观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大，倾斜培养瓶时细胞层能自然流即可终止，此时应加入2-3ml含血清的培养液终止消化（细胞的解离时间标准可能偏差，根据细胞来源确定，有些细胞属于半贴壁，无需胰蛋白酶也可解离）。
——吸取所有培养皿内的液体，沿培养皿底部缓慢吹打，重复该动作2-3次，使所有细胞沿瓶底流下，再轻柔地把细胞吹打成单个悬液（吹打过程中应尽量避免气泡的产生）。
——把所有的细胞悬液转移到15ml离心管中，800-1000rpm离心3-5分钟后弃上清。
——加入培养基重悬成单细胞悬液。按实验所需的细胞量添加到新的培养皿中，将培养皿37 ℃孵育，每天观察细胞的贴壁情况。
注意：向培养皿加液体时，建议从与贴壁细胞层相对的容器一侧轻轻加入冲洗液，以避免搅动细胞层，前后摇晃容器数次，最后移弃冲洗液。若是悬浮细胞传代培养，过程中省消化步骤。
细胞冻存
——按照“细胞传代”中的步骤收集细胞。
——加入细胞冻存液（一般10%dmso+对应细胞的培养基），重悬细胞，使细胞的终密度为(5~10)×10^5个/ml，移入细胞冻存管中。
——程序降温，更推荐使用程序降温盒。若手动进行降温，冻存的一般程序为降温速度1～2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可将降温速度增加至5℃～10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。
污染控制
1、设备的清洁与灭菌
在开始任何细胞培养实验之前，必须对所有设备、耗材和试剂进行灭菌处理，当然，我们推荐实验人员尽量选择商品化的无菌试剂。
灭菌方法包括高压灭菌、过滤、紫外线照射、乙醇喷洒或擦拭、消毒清洁试剂喷洒或擦拭等。
2、环境的清洁与灭菌
所有细胞培养工作应在无菌和清洁的环境中进行。因此要对实验环境进行清洁与灭菌。
包括实验前对实验空间定期清洁，包括桌面、地面、墙面、生物安全柜操作台等，开始实验前，还应打开生物安全柜中的紫外线灯进行照射灭菌。
除了常规的消毒试剂，这里推荐使用德国minerva biolabs的mycoplasma-off支原体祛除喷雾剂，不仅对支原体起作用，还能高效清除并预防细菌、真菌等污染物。水浴锅、培养箱水槽等环境，可以添加water shield™，有效预防水源中的支原体、细菌、真菌、霉菌、孢子的污染。
3、正确处理实验材料
正确处理实验材料，实验操作应符合相关规定、避免交叉污染。包括佩戴适当的个人防护设备，如手套、口罩；及时更换移液器一次性器具等操作。
4、实验室合理布局
在实验过程中，严格遵守实验室中物品摆放准则，以培养箱举例：培养皿摆放密度应合理，宜少不宜多等。
5、定期监测培养物
定期监测培养物，对于及早发现和解决而言，也是一个关键点。这包括在显微镜下检查培养物状态、肉眼观察培养基的形态、颜色等变化等。必要时可以使用pcr技术定期测试微生物污染的存在。
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1、明确细胞身份
在实验正式开始前，需要根据实验目的，确定所需的细胞系。不同的细胞系在形态、生理、代谢和功能等方面有很大的差异。选择适合研究目的的细胞系可以增加实验的准确性和可靠性。
选择来源靠谱的细胞系（细胞类型、细胞来源、细胞代数等信息），根据不同细胞来源，寻找相应的细胞培养资料，明确培养基种类、培养物添加量、培养条件（温度、湿度、二氧化碳浓度）等。
2、实验室环境清洁
在细胞实验开始前，需要对细胞培养环境进行清洁消毒甚至是灭菌处理。仪器、培养室墙壁与地面、培养室空间都应采取对应的清洁措施。
3、准备实验材料
选择高品质的实验耗材与试剂，尽可能选择无菌化处理过后的，若非无菌级，则需自行灭菌后才可用于细胞培养。
胎牛血清是许多细胞培养实验中一种重要的添加物。提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。还能够提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调节它们所结合的物质活力。
ausbian进口特级胎牛血清，精选内毒素更低批次（≤3eu/ml），澳洲血源，是细胞典藏等重大项目十几年的稳定供应品牌。新批次在试用前，提供试用服务，养细胞更放心。全程冷链运输，减少反复冻融对胎牛血清品质的影响。
实验过程
细胞复苏
——液氮中取出的细胞，待液氮挥发后，马上将细胞冻存管置于37℃水浴中轻轻摇动使快速融化（尽量控制在2min内，时间过长了可能会影响细胞的状态）。在解冻时，冻存管瓶口尽量控制在水面以上。
——解冻后，将冻存管转移到无菌操作台，75%酒精擦拭冻存管外部。
——将细胞悬液转移至，装有37℃预热的培养基离心管中，800-1000rpm离心3-5分钟，弃上清。
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——用移液器吸取并丢弃使用过的细胞培养基（不要直接倒掉，避免瓶口残留导致易污染），并用pbs缓慢冲洗细胞2次。
——以直径10cm的培养皿为例，向培养皿中加入500μl胰蛋白酶-edta（根据各细胞的使用说明，选择合适的浓度）消化液，轻轻摇动培养皿，使消化液流遍所有细胞表面，放到37℃孵育（一般2分钟左右即可）。镜下观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大，倾斜培养瓶时细胞层能自然流即可终止，此时应加入2-3ml含血清的培养液终止消化（细胞的解离时间标准可能偏差，根据细胞来源确定，有些细胞属于半贴壁，无需胰蛋白酶也可解离）。
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——把所有的细胞悬液转移到15ml离心管中，800-1000rpm离心3-5分钟后弃上清。
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2、环境的清洁与灭菌
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3、正确处理实验材料
正确处理实验材料，实验操作应符合相关规定、避免交叉污染。包括佩戴适当的个人防护设备，如手套、口罩；及时更换移液器一次性器具等操作。
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