一种以微观方式标记抗体的试剂盒
readilink 快速抗体标记试剂盒提供了一种以微观方式标记抗体的便捷方法。 该试剂盒仅需要两个简单的混合步骤而无需纯化步骤。试剂盒中使用的ifluor 和mfluor 染料的琥珀酰亚胺酯（se）显示出与蛋白质的脂族胺的良好反应性和选择性，并形成羧酰胺键，其与天然肽键相同且稳定。 ifluor 和mfluor-抗体缀合物可用于免疫荧光染色，荧光原位杂交，流式细胞术和其他生物学应用。每个readilink rapid抗体标记试剂盒都提供了进行两次偶联反应（2x50μg蛋白质）的所有必需成分。每个试剂盒可用于标记50-100μg单克隆，多克隆抗体或其他蛋白质（> 10 kda），只需两个简单的混合步骤。
readilink 快速试剂盒标记原理
1.通过在反应缓冲液（ph 7.5-8.5）中将标记染料与蛋白质（待标记的）混合，开始标记反应2.孵育得到所需蛋白质缀合物和非反应性游离染料的混合物。
3.通过将非荧光tide quencher （tq）染料与反应溶液混合来淬灭反应。tq染料阻止反应并将非反应性自由标记染料转化为非荧光tq标记染料复合物，这消除了游离标记染料的背景荧光干扰。
试剂盒组成
组分
含量
储存
组分 a：mitolite red
2 vial (one vial is for 50 ug protein)
—20℃
组分 b：live cell staining buffer
1 vial (20ul)
—20℃
组分 c：tq -dyed quench buffer
1 vial (20ul)
—20℃
标准操作规程（标记50μg蛋白质）
将所有组分加热并在打开前将样品瓶短暂离心，并在开始结合前立即准备所需的溶液。 以下sop是标记抗hdac igg抗体的实例。
1.准备蛋白质溶液（溶液a）：
为了标记50μg蛋白质（假设目标蛋白质浓度为1 mg / ml），将5μl（总反应体积的10％）反应缓冲液（组分b）与50μl目标蛋白质溶液混合。
注1：如果蛋白质浓度不同，请相应调整蛋白质体积，使~50μg蛋白质可用于标记反应。
注2：为了标记100μg蛋白质（假设目标蛋白质浓度为1 mg / ml），将10μl（总反应体积的10％）反应缓冲液（组分b）与100μl目标蛋白质溶液混合。
注3：蛋白质应溶解于ph7.2-7.4的1x磷酸盐缓冲盐水（pbs）中;如果蛋白质溶解在甘氨酸缓冲液中，必须用1x pbs（ph 7.2-7.4）透析，或使用amicon ultra-0.5，ultracel-10膜，10 kda（来自millipore的cat＃ufc501008）去除游离胺或铵盐（如硫酸铵和乙酸铵）。
注4：用牛血清白蛋白（bsa）或明胶稳定的不纯抗体。
注5：如果蛋白质浓度低于1 mg / ml，结合效率会显著降低。为获得标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为1-2 mg / ml。
2.运行结合反应：
2.1将蛋白质溶液（溶液a）加入一小瓶标记染料（组分a）中，通过反复移液几次将其充分混合，或将小瓶涡旋几秒钟。
注意：使用标记染料的两个小瓶（组分a）通过将100μg蛋白质分成2x50μg蛋白质并使每个50μg蛋白质与一小瓶标记染料反应来标记100μg蛋白质。 将两个小瓶合并用于下一步。
2.2将缀合反应混合物在室温下保持30-60分钟。
注意：如果需要，可以旋转或摇动缀合反应混合物更长的时间。
3.停止共轭反应：
3.1加入5ul（50μg蛋白质）或10μl（100μg蛋白质），这是tq染色猝灭缓冲液（组分c）总反应体积的10％到共轭反应混合物中（来自步骤2.2），混合。
3.2在室温下孵育10分钟。
3.3使用标记的蛋白质（抗体）。
蛋白质共轭物的储存
蛋白质缀合物应在载体蛋白（例如0.1％牛血清白蛋白）存在下以> 0.5mg / ml储存。 为了更长时间的储存，可以将蛋白质缀合物冻干或分成单次使用的等分试样并在≤-20℃下储存。
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3.通过将非荧光tide quencher （tq）染料与反应溶液混合来淬灭反应。tq染料阻止反应并将非反应性自由标记染料转化为非荧光tq标记染料复合物，这消除了游离标记染料的背景荧光干扰。
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注1：如果蛋白质浓度不同，请相应调整蛋白质体积，使~50μg蛋白质可用于标记反应。
注2：为了标记100μg蛋白质（假设目标蛋白质浓度为1 mg / ml），将10μl（总反应体积的10％）反应缓冲液（组分b）与100μl目标蛋白质溶液混合。
注3：蛋白质应溶解于ph7.2-7.4的1x磷酸盐缓冲盐水（pbs）中;如果蛋白质溶解在甘氨酸缓冲液中，必须用1x pbs（ph 7.2-7.4）透析，或使用amicon ultra-0.5，ultracel-10膜，10 kda（来自millipore的cat＃ufc501008）去除游离胺或铵盐（如硫酸铵和乙酸铵）。
注4：用牛血清白蛋白（bsa）或明胶稳定的不纯抗体。
注5：如果蛋白质浓度低于1 mg / ml，结合效率会显著降低。为获得标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为1-2 mg / ml。
2.运行结合反应：
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注意：使用标记染料的两个小瓶（组分a）通过将100μg蛋白质分成2x50μg蛋白质并使每个50μg蛋白质与一小瓶标记染料反应来标记100μg蛋白质。 将两个小瓶合并用于下一步。
2.2将缀合反应混合物在室温下保持30-60分钟。
注意：如果需要，可以旋转或摇动缀合反应混合物更长的时间。
3.停止共轭反应：
3.1加入5ul（50μg蛋白质）或10μl（100μg蛋白质），这是tq染色猝灭缓冲液（组分c）总反应体积的10％到共轭反应混合物中（来自步骤2.2），混合。
3.2在室温下孵育10分钟。
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