诱导HT29分化为成熟杯状细胞HT29-MTX-E12培养说明书
诱导ht29分化为成熟杯状细胞ht29-mtx-e12培养说明书
一、细胞培养条件
细胞名称
诱导ht29分化为成熟杯状细胞ht29-mtx-e12
生长特性
贴壁生长
冻存条件
无血清冻存液（货号：c7001）
培养体系
dmem+10%fbs+1%双抗
传代方法
第一次建议1:2传代
传代情况
2天换液
备注
用无菌离心管收集瓶子培养基，留作过渡对比培养
如对比培养效果不好，建议直接购买我们的培养基
二、细胞收到后处理
培养至良好状态后灌满培养液并封好瓶口是运输细胞的最好办法。收到细胞用75%酒精喷洒整个细胞瓶，消毒后放到超净台内严格无菌操作，将细胞瓶放入37℃、5%co2的培养箱中静置3-4小时以稳定细胞状态后再做处理。显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照保存（最好40x,100x,200x各一张），前三天照片是重要售后依据，不提供照片默认收到状态良好。（传代后建议一瓶用原瓶的培养基，另外一瓶用自己配的培养基，以便进行对比培养，换液后将盖子拧松）
三、细胞培养步骤
a、细胞传代：如果未超过80%汇合度时，将瓶装的培养液收集至离心管中，留5ml培养基，放入37℃、5%co2孵箱培养；如果细胞密度超80%，即可进行传代培养，传代具体步骤如下：
1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的pbs润洗细胞1-2次。
2. 添加1-2ml消化液（0.25-0.53mm edta）至培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上培养基终止消化。
3.轻轻吹打细胞，使之全脱落后吸出，然后将悬液转移至15ml离心管中，在1000rpm条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml培养基重悬。
4. 将细胞悬液按1：2的比例进行分瓶传代（两个t25瓶），补充新的培养基至5-8ml/瓶，最后放入到37℃、5%co2的细胞培养箱中培养。
b、细胞冻存：
1、细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃t25培养瓶中的培养液，用pbs清洗细胞一次；
2、添加0.25%-edta消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入5ml培养液终止消化，再轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心 5min；
3、 弃上清，沉淀细胞加入1ml的雅吉生物无血清冻存液（货号：c7001），混匀后加入冻存管中。
4、 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱即可，如后期要将细胞转入液氮罐中，则需在-80℃冰箱 中存放24小时以上再转入液氮罐中。
细胞复苏：
从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护面具），快速将其置入 37℃水浴中解冻， 直至冻存管中无结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁；
将冻存管中的细胞移至含 5ml 培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5min；
弃上清，沉淀用5ml培养基重悬，接种至t25培养瓶，放于37℃,5%co2细胞培养箱中培养；
第二天，换用新鲜培养基继续培养。
注意事项：有些细胞贴壁不牢，在运输过程中容易发生细胞脱落，这是正常现象。如脱离较多可按此方法：将培养瓶所有培养液收集至离心管，1000rpm离心5min，收集上清作过渡培养（后期对比培养），沉淀加入1-2ml，轻轻吹打，重悬，消化1-2分钟后，加5ml培养基终止反应。再离心，弃上清，加1-2ml养基重悬。然后按1:2比例进行分瓶传代（两个t25），补充新的培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃,5%co2细胞培养箱中培养。
五、售后条款：
1）细胞出现问题，可重发的情况有哪些？判定标准是什么？
1. 细胞运输途中遭遇的各种问题，细胞丢失、瓶身破损、培养液严重漏液等，重发；
2. 细胞污染问题，请在收到产品48小时内，给我们提出真实的实验结果，核实后重发；
3. 常温发货的细胞静置24小时后，干冰冻存发货的细胞复苏后24小时后，绝大多数细胞未存活，（需提供真实清晰的细胞状态照片），重发；
4. 干冰冻存发货的细胞复苏后24小时后或常温发货的细胞静置4小时候并且未开封，出现污染，重发；
5. 细胞活性问题，请在收到产品7天内给我们提出真实的实验结果，用台盼蓝染色法鉴定细胞活力，核实后予重发；
6. 细胞收到当天以及第2,3天请拍照，3天未告知的，视为产品合格。4-7天内出现问题有提供收到细胞前3天照片和细胞出现问题时照片以及细胞相关操作的详细步骤的，并跟技术人员沟通的，由技术人员判定为我方责任的，重发。技术人员判定为双方承担责任的由双方进行协商处理或者按合同价的50%收费重发。
2）细胞出现问题，不予以重发的情况有哪些？
1. 客户造成细胞污染，不重发；
2. 客户不正确操作致细胞状态不好，不重发；
3. 非本库推荐细胞培养体系致的细胞状态不好，不重发；
4. 细胞状态不好，未提供细胞培养前3天照片的，不重发；
5. 细胞培养时经其它处理的，不重发；
6. 细胞收到2天内，未告知，不重发；
7. 视具体情况而定。
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传代方法
第一次建议1:2传代
传代情况
2天换液
备注
用无菌离心管收集瓶子培养基，留作过渡对比培养
如对比培养效果不好，建议直接购买我们的培养基
二、细胞收到后处理
培养至良好状态后灌满培养液并封好瓶口是运输细胞的最好办法。收到细胞用75%酒精喷洒整个细胞瓶，消毒后放到超净台内严格无菌操作，将细胞瓶放入37℃、5%co2的培养箱中静置3-4小时以稳定细胞状态后再做处理。显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照保存（最好40x,100x,200x各一张），前三天照片是重要售后依据，不提供照片默认收到状态良好。（传代后建议一瓶用原瓶的培养基，另外一瓶用自己配的培养基，以便进行对比培养，换液后将盖子拧松）
三、细胞培养步骤
a、细胞传代：如果未超过80%汇合度时，将瓶装的培养液收集至离心管中，留5ml培养基，放入37℃、5%co2孵箱培养；如果细胞密度超80%，即可进行传代培养，传代具体步骤如下：
1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的pbs润洗细胞1-2次。
2. 添加1-2ml消化液（0.25-0.53mm edta）至培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上培养基终止消化。
3.轻轻吹打细胞，使之全脱落后吸出，然后将悬液转移至15ml离心管中，在1000rpm条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml培养基重悬。
4. 将细胞悬液按1：2的比例进行分瓶传代（两个t25瓶），补充新的培养基至5-8ml/瓶，最后放入到37℃、5%co2的细胞培养箱中培养。
b、细胞冻存：
1、细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃t25培养瓶中的培养液，用pbs清洗细胞一次；
2、添加0.25%-edta消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入5ml培养液终止消化，再轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心 5min；
3、 弃上清，沉淀细胞加入1ml的雅吉生物无血清冻存液（货号：c7001），混匀后加入冻存管中。
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弃上清，沉淀用5ml培养基重悬，接种至t25培养瓶，放于37℃,5%co2细胞培养箱中培养；
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1）细胞出现问题，可重发的情况有哪些？判定标准是什么？
1. 细胞运输途中遭遇的各种问题，细胞丢失、瓶身破损、培养液严重漏液等，重发；
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3. 常温发货的细胞静置24小时后，干冰冻存发货的细胞复苏后24小时后，绝大多数细胞未存活，（需提供真实清晰的细胞状态照片），重发；
4. 干冰冻存发货的细胞复苏后24小时后或常温发货的细胞静置4小时候并且未开封，出现污染，重发；
5. 细胞活性问题，请在收到产品7天内给我们提出真实的实验结果，用台盼蓝染色法鉴定细胞活力，核实后予重发；
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1. 客户造成细胞污染，不重发；
2. 客户不正确操作致细胞状态不好，不重发；
3. 非本库推荐细胞培养体系致的细胞状态不好，不重发；
4. 细胞状态不好，未提供细胞培养前3天照片的，不重发；
5. 细胞培养时经其它处理的，不重发；
6. 细胞收到2天内，未告知，不重发；
7. 视具体情况而定。
关键词：培养箱 显微镜 细胞培养箱 倒置显微镜
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