成年猪胰岛分离纯化方法的优化
成年猪胰岛分离纯化方法的优化
实验试剂
胶原酶v，512 kut/mg(sigma公司)，dna酶(sigma公司)，胎牛血清(gibco公司)，rpmi1640培养液(gibco公司)，dextran(pharmacia公司)，hanks*(gibco公司)。
实验设备
离心机，注射器，显微镜，超净工作台等。
实验材料
成年种猪，猪龄12 mo，体质量150 kg左右，猪被屠宰放血后，在相对无菌条件下迅速取出胰腺，保存于4℃ hanks液中送至实验室，热缺血时间少于10 min，冷缺血时间少于90 min。
实验步骤
1. 胰岛分离
胰腺取回后，置于超净工作台上，快速去除胰周组织、脂肪、血管及外科被膜，保留固有被膜。从胰头、胰体交界部横断胰腺，找到主胰管，用20 g*插入，缝合线结扎，尾部远端亦结扎切断，每次均取约15-20 g组织，注入4℃含ca2hanks液配制的复合*(1.5 g/l，内含dna酶0.3 g/l)，注入量 = 胰质量×2，注射速度7 ml/min，3-4 min内完成，置入玻璃容器内，在38.5±0.1℃水浴中震荡消化，震速100 r/min，在消化过程中间断加入0.1 mmol/l的naoh，使消化液ph值尽可能维持在7.8左右，从消化20 min开始每间隔4 min取样一次，双硫腙染色镜检，当胰腺组织被消化裂解成细沙状，镜检见大部分结构完整的胰岛从外分泌组织中脱落出来，立即用4℃冷hanks液(含100 ml/l胎牛血清)终止消化，充分混匀后，用40目钢网过滤，收集消化后组织，4℃离心冼涤2次，去除脂肪等杂质细胞，取样镜检计数和观察消化后胰岛分离情况。
2. 胰岛纯化
用dextran配制成密度为1.037，1.054，1.070，1.096，1.11 kg/l的不连续密度梯度液，依次将不连续密度梯度液各10 ml加入50 ml离心管中，后将洗涤后的消化组织每0.5 ml与1.037 kg/l密度梯度液10 ml混匀，小心移至离心管中液体上层，形成不连续密度梯度。将2-4个离心管置入低温离心机中，先800 r/min离心5 min，然后2 500 r/min离心15 min，离心后在1.096-1.054 kg/l之间收集纯化的胰岛，4℃离心洗涤2次。分别取样镜检计数，估计纯度和行生物学活性及组织学鉴定。
3. 胰岛计数和纯度测定
分离纯化后的组织悬液用双硫腙(双硫腙10 mg，无水乙醇3 ml，250 g/l氨水50 ml)进行染色，光镜下胰岛细胞团染成腥红色或红色，外分泌组织不着色，呈圆形、椭圆形或不规则形.在显微镜下计数直径≥50 mm的胰岛算出每克胰腺组织分离的胰岛当量数，纯度用内、外分泌组织量的比值来估计。
4. 胰岛生物学活性鉴定
将纯化后胰岛细胞悬液放置在显微镜下，用巴氏吸管吸取胰岛放入培养板中，每10个胰岛当量(每1个胰岛当量相当于直径150 mm的胰岛细胞团，ie)的成年猪胰岛(apis)置入一个培养孔，6孔为1组，共4组.每组分别置入无糖培养基、含5.6 mmol/l葡萄糖(低糖)、16.7 mmol/l葡萄糖(高糖)、16.7 mmol/l葡萄糖加10 mmol/l*(高糖 *)的rpmi1640培养液中，置于37℃、含50 ml/l co2的培养箱中孵育4 h，收集培养液，用胰岛素放免试剂盒(中科院原子能研究所)测定胰岛素含量.
5. 胰岛组织学检查
离心纯化后胰岛细胞悬液，收集胰岛组织，用*固定，石蜡包埋切片，he染色检查胰岛组织结构完整性。
6. 统计学处理
所得数据以mean±sd表示，组间均数差异用t检验比较，p<0.05为有差异。
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实验设备
离心机，注射器，显微镜，超净工作台等。
实验材料
成年种猪，猪龄12 mo，体质量150 kg左右，猪被屠宰放血后，在相对无菌条件下迅速取出胰腺，保存于4℃ hanks液中送至实验室，热缺血时间少于10 min，冷缺血时间少于90 min。
实验步骤
1. 胰岛分离
胰腺取回后，置于超净工作台上，快速去除胰周组织、脂肪、血管及外科被膜，保留固有被膜。从胰头、胰体交界部横断胰腺，找到主胰管，用20 g*插入，缝合线结扎，尾部远端亦结扎切断，每次均取约15-20 g组织，注入4℃含ca2hanks液配制的复合*(1.5 g/l，内含dna酶0.3 g/l)，注入量 = 胰质量×2，注射速度7 ml/min，3-4 min内完成，置入玻璃容器内，在38.5±0.1℃水浴中震荡消化，震速100 r/min，在消化过程中间断加入0.1 mmol/l的naoh，使消化液ph值尽可能维持在7.8左右，从消化20 min开始每间隔4 min取样一次，双硫腙染色镜检，当胰腺组织被消化裂解成细沙状，镜检见大部分结构完整的胰岛从外分泌组织中脱落出来，立即用4℃冷hanks液(含100 ml/l胎牛血清)终止消化，充分混匀后，用40目钢网过滤，收集消化后组织，4℃离心冼涤2次，去除脂肪等杂质细胞，取样镜检计数和观察消化后胰岛分离情况。
2. 胰岛纯化
用dextran配制成密度为1.037，1.054，1.070，1.096，1.11 kg/l的不连续密度梯度液，依次将不连续密度梯度液各10 ml加入50 ml离心管中，后将洗涤后的消化组织每0.5 ml与1.037 kg/l密度梯度液10 ml混匀，小心移至离心管中液体上层，形成不连续密度梯度。将2-4个离心管置入低温离心机中，先800 r/min离心5 min，然后2 500 r/min离心15 min，离心后在1.096-1.054 kg/l之间收集纯化的胰岛，4℃离心洗涤2次。分别取样镜检计数，估计纯度和行生物学活性及组织学鉴定。
3. 胰岛计数和纯度测定
分离纯化后的组织悬液用双硫腙(双硫腙10 mg，无水乙醇3 ml，250 g/l氨水50 ml)进行染色，光镜下胰岛细胞团染成腥红色或红色，外分泌组织不着色，呈圆形、椭圆形或不规则形.在显微镜下计数直径≥50 mm的胰岛算出每克胰腺组织分离的胰岛当量数，纯度用内、外分泌组织量的比值来估计。
4. 胰岛生物学活性鉴定
将纯化后胰岛细胞悬液放置在显微镜下，用巴氏吸管吸取胰岛放入培养板中，每10个胰岛当量(每1个胰岛当量相当于直径150 mm的胰岛细胞团，ie)的成年猪胰岛(apis)置入一个培养孔，6孔为1组，共4组.每组分别置入无糖培养基、含5.6 mmol/l葡萄糖(低糖)、16.7 mmol/l葡萄糖(高糖)、16.7 mmol/l葡萄糖加10 mmol/l*(高糖 *)的rpmi1640培养液中，置于37℃、含50 ml/l co2的培养箱中孵育4 h，收集培养液，用胰岛素放免试剂盒(中科院原子能研究所)测定胰岛素含量.
5. 胰岛组织学检查
离心纯化后胰岛细胞悬液，收集胰岛组织，用*固定，石蜡包埋切片，he染色检查胰岛组织结构完整性。
6. 统计学处理
所得数据以mean±sd表示，组间均数差异用t检验比较，p<0.05为有差异。
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