冰冻切片免疫荧光实验步骤
冰冻切片免疫荧光实验步骤
1、冰冻切片固定
冰冻切片37℃烘烤10至20分钟，控干水分，置于4%多聚甲醛固定30min。于pbs缓冲液中晃动洗涤3次，每次5分钟。
2、抗原修复
将切片浸没在升满edta抗原修复缓冲液（ph8.0）的修复盆中，置于微波炉内进行抗原修复，修复条件：中火8min至沸——停火8min保温——中低火7min（整个过程需防止修复液过度蒸发，切勿干片。
自然冷却后，将切片置于pbs缓冲液中。然后在摇床上，晃动洗涤3次，每次5min。
3、画圈血清封闭
切片稍甩干后，用组化笔在组织周围画圈，滴加组织自发荧光淬灭剂a液，室温孵育30min，纯水洗5分钟，接着滴加bsa牛血清白蛋白，封闭30min。
4、加一抗
轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加按比例配好的一抗后，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜。
5、加二抗
切片浸没在pbs缓冲液中，然后在摇床上，晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后，滴加荧光二抗，覆盖组织，避光室温孵育50min。
6、dapi复染细胞核
切片浸没在pbs缓冲液中，晃动洗涤3次，每次5min。甩干后，在圈内滴加即用型dapi染液，避光室温孵育10min。
7、淬光组织自发荧光
切片置于pbs缓冲液中，晃动洗涤3次，每次5min。在圈内滴加组织自发荧光淬灭剂b液，避光室温孵育5min，水洗10min。
8、封片
切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片，推荐使用远慕生物配套试剂、耗材、仪器，实验效果更佳！
冰冻切片免疫荧光结果判读：
dapi染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光或绿光等。
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自然冷却后，将切片置于pbs缓冲液中。然后在摇床上，晃动洗涤3次，每次5min。
3、画圈血清封闭
切片稍甩干后，用组化笔在组织周围画圈，滴加组织自发荧光淬灭剂a液，室温孵育30min，纯水洗5分钟，接着滴加bsa牛血清白蛋白，封闭30min。
4、加一抗
轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加按比例配好的一抗后，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜。
5、加二抗
切片浸没在pbs缓冲液中，然后在摇床上，晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后，滴加荧光二抗，覆盖组织，避光室温孵育50min。
6、dapi复染细胞核
切片浸没在pbs缓冲液中，晃动洗涤3次，每次5min。甩干后，在圈内滴加即用型dapi染液，避光室温孵育10min。
7、淬光组织自发荧光
切片置于pbs缓冲液中，晃动洗涤3次，每次5min。在圈内滴加组织自发荧光淬灭剂b液，避光室温孵育5min，水洗10min。
8、封片
切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片，推荐使用远慕生物配套试剂、耗材、仪器，实验效果更佳！
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