液相色谱柱的选择方法概述
液相色谱柱的选择方法概述
选择方法一：填料的种类
填料的基质一般选择使用多孔硅胶或聚合物等，在细孔的表面有多种经过化学修饰的官能团。
利用目标成分疏水性的不同起到分离效果的反相分离模式，利用极性不同进行分离的正相分离模式，根据分子大小的不同而分离的尺寸排阻模式，根据离子性质的不同而达到分离的离子交换模式，又或者分离光学异构体等，根据目的的不同，需要
选择对应的填料。
作为填充剂的代表十八烷基、辛基、丁基等即在硅胶的细孔表面化学键合的 c18（ods）、c8 或 c4 等，碳链越长，疏水性（保留能力）越强。
选择方法二：填料孔径
多孔硅胶为基体的填料表面具有无数的细孔，需要根据目的成分的分子量选择对应大小的填料孔径。微孔径 100å（10nm）对 应 5000 左右 的 分 子 量。 分 子 量 大 于 5000 的， 可 以 选 择300å（30nm）或以上的大孔径柱子。目的成分能够进入孔的话，才能与官能团相互作用从而起到分离的效果。对于大分子蛋白质或聚合物等高分子，如果不是大孔径的基体，与官能团的相互作用就会减少。另外，分析低分子时，选择太大的微孔，由于会扩散故导致峰型可能会展宽。
选择方法三：填料粒径
一般 hplc 多使用粒径为 5μm 的球状硅胶，近年来也逐步开始使用 2μm 以下的微粒子，粒径越小色谱柱理论塔板数就越高，得到峰型也就越尖锐，分离越好。而且，粒径越小，即使流速上升，理论塔板数降低很少，微粒子色谱柱越来越适合快速分析。但是，微粒子使用时，必须注意使用压力。3μm 以下适合uhplc快速分析，3 ～ 5μm 适合一般的 hplc 柱分析，10μm 则作为制备 hplc 柱使用。
选择方法四：色谱柱尺寸 （长度）
一般使用较多的色谱柱的长度，通用型，制备 hplc 柱长度为150 ～ 250mm，lc/ms 为 100-150mm，超快速 hplc（uhplc）为 50-100mm。色谱柱长度越长理论塔板数也越高。只是，需要注意，色谱柱长度加倍后，分析时间与使用压力也会加倍。
对于 2μm 或者 3μm 的微粒子，分离度和理论塔板数都较好时，将色谱柱的长度变短，可以缩短分析时间，进行快速分析。
选择方法五：色谱柱尺寸 （内径）
一般通用的 hplc 柱内径为 4.6mm，lc/ms 内径多为 2.1mm，毛细管 hplc 色谱柱为不满 1mm，制备 hplc 色谱柱6.0mm 以上。通用 hplc 系列，内径不同得到的结果也不同。即使改变内径，根据色谱柱的截面积比改变相应的流速，保留时间基本不会改变。特别是对于像 uv、ri 一样对于浓度要求很高的检测器而言，流速越小，其对应的灵敏度也越高。需要注意的是，通用型 hplc 色谱柱内径太小，装置的死体积（管路内多余的配管或者流通池容量）影响变大，峰型会变宽。并且根据 hplc 系统使用目的的不同（分析、制备、毛细管等）种类也不同，能够设定的正确的流速与流速范围，系统响应等也会不同，所以根据系统不同选择对应的内径是十分重要的。
选择方法六：端基封尾
端基封尾是硅胶表面有一种被称为硅醇基的弱酸性官能团（si-oh）存在。作为反相分配填料等合成时，利用硅醇基对十八烷基（ods：c18）进行化学键合。然而，部分没有键合残留的硅醇基会与碱性化合物吸附，引起峰拖尾。为了防止这种现象，使用甲基等短链基团对残存硅醇基进行处理，这个过程就称作端基封尾。选择 ods 色谱柱时，请选择进行端基封尾的柱子。下述作为参考，反相色谱柱的一些相互作用。
相互作用的类型：
◆疏水性相互作用
疏水性高的物质之间会有相互牵引作用，与相似相溶道理一样，填料结合基团的碳链（烷基链）越长疏水性越高。
◆离子性相互作用
在反相分析中，弱酸性的硅醇基能与碱性化合物结合，与酸性化合物会发生排斥，会对峰型及保留时间有影响。更适合使用端基封尾处理的柱子或者调节溶剂的 ph 值，抑制这种作用。
◆氢键
氢原子易与电负性高的原子发生结合，如与氧、氮、硫、卤素以及芳香环的 π 电子等作用。
◆π 电子相互作用
像苯环这类具有 π 电子结构的化合物，相互之间会有电子吸引作用。像苯基柱这类具 π 电子作用的柱子，对于目标物的 π 电子具有选择性，通过此相互作用起到分离效果。
◆金属配位吸附
填充剂硅胶基质内会含有部分残留的金属，故易会引起配位化合物的吸附现象。而且，解离的硅醇基与金属离子一旦发生配位，会发生峰拖尾或者目的成分不能被洗脱的状况。
选择方法七：色谱柱接头形式
hplc 色谱柱的接头根据厂家的不同也会有不同。一般分析色谱柱是 1/16 英寸外径的管子使用螺丝进行连接，若连接不同的接口，较易产生死体积与漏液现象。
特别对于不锈钢的配管等，需用套圈固定管子，就必须选择对应的接口形式。
接口形式和螺距有英寸螺距和毫米螺距两种。一般 waters 接口型使用比较普遍。无论是 hplc 或 uhplc，通过选择适当的色谱柱接口形式，inertsustain 以及 inertsil 的性能能够充分的发挥（标准接口为 waters 接口型）。
选择方法八：经常使用的色谱柱规格
◆hplc 分析
5μm, 150×4.6mm i.d.
5μm, 250×4.6mm i.d.
◆uhplc, lc/ms 分析
2μm, 50×2.1mm i.d.
2μm, 100×2.1mm i.d.
3μm, 75×2.1mm i.d.
◆lc/ms 分析
3μm, 100×2.1mm i.d.
3μm, 150×2.1mm i.d.
5μm, 150×2.1mm i.d
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选择对应的填料。
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多孔硅胶为基体的填料表面具有无数的细孔，需要根据目的成分的分子量选择对应大小的填料孔径。微孔径 100å（10nm）对 应 5000 左右 的 分 子 量。 分 子 量 大 于 5000 的， 可 以 选 择300å（30nm）或以上的大孔径柱子。目的成分能够进入孔的话，才能与官能团相互作用从而起到分离的效果。对于大分子蛋白质或聚合物等高分子，如果不是大孔径的基体，与官能团的相互作用就会减少。另外，分析低分子时，选择太大的微孔，由于会扩散故导致峰型可能会展宽。
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一般 hplc 多使用粒径为 5μm 的球状硅胶，近年来也逐步开始使用 2μm 以下的微粒子，粒径越小色谱柱理论塔板数就越高，得到峰型也就越尖锐，分离越好。而且，粒径越小，即使流速上升，理论塔板数降低很少，微粒子色谱柱越来越适合快速分析。但是，微粒子使用时，必须注意使用压力。3μm 以下适合uhplc快速分析，3 ～ 5μm 适合一般的 hplc 柱分析，10μm 则作为制备 hplc 柱使用。
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一般使用较多的色谱柱的长度，通用型，制备 hplc 柱长度为150 ～ 250mm，lc/ms 为 100-150mm，超快速 hplc（uhplc）为 50-100mm。色谱柱长度越长理论塔板数也越高。只是，需要注意，色谱柱长度加倍后，分析时间与使用压力也会加倍。
对于 2μm 或者 3μm 的微粒子，分离度和理论塔板数都较好时，将色谱柱的长度变短，可以缩短分析时间，进行快速分析。
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一般通用的 hplc 柱内径为 4.6mm，lc/ms 内径多为 2.1mm，毛细管 hplc 色谱柱为不满 1mm，制备 hplc 色谱柱6.0mm 以上。通用 hplc 系列，内径不同得到的结果也不同。即使改变内径，根据色谱柱的截面积比改变相应的流速，保留时间基本不会改变。特别是对于像 uv、ri 一样对于浓度要求很高的检测器而言，流速越小，其对应的灵敏度也越高。需要注意的是，通用型 hplc 色谱柱内径太小，装置的死体积（管路内多余的配管或者流通池容量）影响变大，峰型会变宽。并且根据 hplc 系统使用目的的不同（分析、制备、毛细管等）种类也不同，能够设定的正确的流速与流速范围，系统响应等也会不同，所以根据系统不同选择对应的内径是十分重要的。
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