HtPot40恒温金属浴在食源沙门菌DNA环介导恒温核酸扩增法检测
食源沙门菌dna环 恒温核酸扩增法检测
沙门菌是食源性致病菌中一个主要的属，在各类细菌性食物中毒事件中，沙门菌造成的食物中毒位居前列〔1，2〕。常规的沙门菌检测方法费时费力，已经不能满足食品生产质量控制的要求〔3〕。因此，需要开发一种灵敏度高并且反应迅速的方法。notomi等开发出一种新的恒温核酸扩增法—环介导恒温核酸扩增法(loop-mediated isothermal amplification of dna，lamp)〔4，5〕。本研究利用dna环介导恒温核酸扩增法对市售不同生肉来源的沙门菌进行快速检测，并且着重在灵敏度和特异性方面对此方法进行验证，以建立的lamp反应条件能够对今后病原微生物的检测研究工作提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 菌株 猪霍乱沙门菌猪霍乱亚种atcc13312(s.atcc13312)(广东省微生物研究所)；其余5株沙门菌hb009，hb371，hb069，hb215，hb143分别分离自市售的生猪肉、海产品、生牛肉、生羊肉和鸡肉。其他属菌株共14株保藏于本实验室，作为沙门菌环介导恒温核酸扩增反应特异性试验中的对照菌株。所有菌株均保存在质脂双层(lb)培养基中。
1.2 仪器及试剂 htpot40恒温金属浴(合肥艾本森科学仪器有限公司)；pcr扩增仪abi2700(美国abi公司)；凝胶成像系统(bio-rad gel doc eq凝胶成像系统)。bst大片段dna聚合酶(爱尔兰biolabs公司)；甜菜碱(分析纯，美国sigma公司)；琼脂糖以及引物合成(大连takara生物公司)。
1.3 方法
1.3.1 lamp反应引物设计 以沙门菌的属特异性基因inva〔6，7〕为靶基因，选择位于8 091～331之间的dna序列作为lamp扩增区域。将待扩增的dna分为6个独立的区域，根据这6个区域分别设计lamp反应所需2对引物(内引物fip和bip、外引物f3和b3)。fip由f2和f1c两部分组成，bip由b2和b1c两部分组成，其2个部分都能分别识别靶dna正义链和反义链独立区域。外引物f3和b3分别识别靶dna上f2和b2的外侧的独立区域，f3序列是5′-gcaacagctacgtgatga-3′；b3序列是5′-ctctattgccggcatcatta-3′。2对引物识别靶dna上6个独立区域。fip由22个碱基f1c和20个碱基f2，以及中间连接的tttt组成，序列是5′-cttagatccccgcattgttggttttccgccacatattatcgcgat-3′；bip由21个碱基b1c和20个碱基b2，以及中间连接的tttt组成，序列是5′-gaccatcatgaatggtcagcattttattggcggtatttcggtcta-3′(引物由大连宝生物公司合成)。
1.3.2 lamp反应 (1)dna模板制备：dna提取参照文献〔8〕。(2)lamp反应体系：25μl反应混合物包括各1.6 μmol/l的fip和bip，各0.2 mol/l的f3和b3，1×恒温缓冲液，1 mol/l的甜菜碱，6 mmol/l的mgso4，1.6 mmol/l的dntp，8 u/μl的大片断dna聚合酶，1 μldna。(3)反应过程：除了大片断dna聚合酶，将其余的试剂混合物于95℃反应5 min，使dna变性。然后迅速于冰上冷却，并加入bst聚合酶，将反应物混匀，置于65℃恒温金属浴中反应60 min，zui后在80℃条件下反应5 min结束反应。(4)lamp产物检测：肉眼观察反应物的外观变化并在2%琼脂糖凝胶上100 v电泳分离25 min，加样量7 μl/上样孔。凝胶置于eb中染色10 min，水洗10 min，在bio-rad gel doc eq凝胶成像系统下照像检测。
关键词：恒温金属浴 扩增仪 凝胶成像系统 金属浴
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1.1 菌株 猪霍乱沙门菌猪霍乱亚种atcc13312(s.atcc13312)(广东省微生物研究所)；其余5株沙门菌hb009，hb371，hb069，hb215，hb143分别分离自市售的生猪肉、海产品、生牛肉、生羊肉和鸡肉。其他属菌株共14株保藏于本实验室，作为沙门菌环介导恒温核酸扩增反应特异性试验中的对照菌株。所有菌株均保存在质脂双层(lb)培养基中。
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1.3 方法
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