细胞DNA常用标记染料
细胞dna常用标记染料
细胞的dna可以被多种染料标记
例如：碘化丙啶（pi）（货号：p9206）溴化乙锭hoechst 染料，主要是 hoechst 33342（货号：s6223） 和 hoechst 33258（货号：s6201）mithramycin a (plicamycin) 光辉霉素a（货号：cb798）dapi（4,6-二脒基-2-苯基吲哚）（货号：p4210）7-氨基放线菌素d（7-aad）（货号：s8221）to-pro-3染色剂色霉素（chromomycin）（货号：s8225）常用的 dna 染料是碘化丙啶 (pi)，可嵌入 dna 双螺旋中并发出强烈的红色荧光（最大发射波长 637nm）。它的优点是可被 488nm 光激发，可用于最常见的台式流式细胞仪。然而，pi染色需要固定或透化细胞，因此细胞无法存活。pi 也会和双链 rna 结合，所以染色时需用rna酶去除。如果需要保证细胞是活的，或者需要同时做表面标记或胞内标记（虽然pi也能用多聚甲醛固定和皂素破膜做，但难度较高），可选择 hoechst 33342，它与 dna 中富含 at 的区域结合，无需固定即可进入活细胞，因此细胞可以在染色之后继续培养或进行后续操作。这种方法的缺点是 hoechst 33342 通过紫外光激发，因此不能用于大多数台式流式细胞仪。pi染色检测细胞周期的染色步骤i.材料1、70% 乙醇，保存在– 20度2、dna 染色液（10ml，新鲜配制）的组成:①triton–x 100 10ul②1mg/ml碘化丙碇 200ul③dnase-free rnase 2mg④pbs 9.79ml注：1mg/ml的pi储存液是由1 mg pi溶于1 ml蒸馏水中配制而成，可在0℃到4℃保存数月。如果rnase不是dnase-free，可将2 mg rnase a在1 ml蒸馏水中煮沸5分钟。ii.步骤取1x106 细胞/管，pbs洗涤两次，每次250g离心5分钟。尽可能*去除上清，加入1ml于－20℃ 预冷的70%乙醇，注意，要边振荡边加。标本保存于-20℃，直至要进行dna染色（可保存数周至数月）染色当天取出标本，于250 x g 离心5分钟，尽可能*去除上清，然后再用pbs洗涤1－2次，离心速度250g×5分钟。加入1 ml dna染色液，充分振荡，染色15分钟即可上机检测。以上是比较快速的步骤您也可以先用rnase作用30分钟（常温或37度均可，但需注意有些细胞可能不适合，需对比测试），然后再用染色液孵育15分钟。这几种作用方式结果无差别：hoechst 33342检测细胞周期的染色步骤在 37°c 下用 hoechst 33342孵育细胞 10-60 分钟。使用的 hoechst 浓度必须预先优化，因为不同细胞的最佳浓度会有所不同，一般在 5-20µg/ml 的范围内。孵育完毕，以 1000 转/分的速度离心5分钟。在 pbs 中洗涤2次。必要时，可加入低浓度的pi孵育1分钟排除死细胞。上机，收集 390nm 和 480nm 波长之间的 hoechst 荧光。分析无论是pi染色还是hoechst 33342染色，均需事先进行粘连体排除，详见：pi检测细胞周期时如何排除粘连体
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