ripa裂解液的成分及使用方法

ripa主要是从动物组织和动物细胞中抽取的可溶性蛋白。ripa裂解液(ripa lysis buffer)是一种传统的细胞组织快速裂解液。ripa裂解液裂解得到的蛋白样品可以用于常规的western、ip等。ripa的本意是radio immunoprecipitation assay。ripa裂解液的配方有很多种，根据其裂解液的强度大致可以分为强、中、弱三类。成分：ripa裂解液(强)的主要成分为50mmtris(ph 7.4)，150mmnacl，1%tritonx-100，1%sodiumdeoxycholate，0.1%sds，以及2mm sodium pyrophosphate，25mm β-glycerophosphate，1mm edta，1mm na3vo4，0.5 ug/ml leupeptin等多种抑制剂。可以有效抑制蛋白降解。ripa裂解液(中)的主要成分为50mm tris(ph 7.4)，150mm nacl，1%np-40，0.5% sodium deoxycholate。使用方法：对于培养细胞样品：1. 融解ripa裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入pmsf，使pmsf的最终浓度为1mm。2.对于贴壁细胞：去除培养液，用pbs、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗)。按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。对于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。裂解液用量说明：通常6孔板每孔细胞加入150微升裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200微升或250微升。对于组织样品：1. 把组织剪切成细小的碎片。2. 融解ripa裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入pmsf，使pmsf的最终浓度为1mm。3. 按照每20毫克组织加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。)4. 用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。5. 充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的page、western和免疫沉淀等操作。6. 如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。注：ripa裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组dna等的复合物。在不检测和基因组dna结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子，例如nfκb、p53等时，通常不必进行超声处理，就可以检测到这些转录因子。

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