GB 31656.1-2021 食品安全国家标准 水产品中甲苯咪唑及代谢物残留量的测定
中华人民共和国国家标准
gb 31656.1-2021
食品安全国家标准
水产品中甲苯咪唑及代谢物残留量的测定
高效液相色谱法
national food safety standard-
determination of mebendazole and its metabolites residue in fishery
products by high performance liquid chromatography
1范围
本文件规定了水产品中甲苯咪唑及其代谢物氨基甲苯咪唑羟基甲苯咪唑残留检测的制样和液相色谱测定方法。
本文件适用于鱼、虾和蟹可食组织中甲苯咪唑及其代谢物氨基甲苯咪唑和羟基甲苯咪唑残留量的检测。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性利用而构成本文件必不可（ke）少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件，不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
gb/t 6682分析实验用水规则和试验方法
gb/t 30891-2014水产品抽样规范
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4原理
试样中残留的甲苯咪唑及其代谢物。用乙酸乙酯提取，正己烷除酯，阳离子固相萃取柱净化，高效液相色谱-紫外检测器测定，外标法定量。
5试剂和材料
以下所用试剂，除另有注明外均为分析纯、水为符合gb/t 6682规定的一级水。
5.1试剂
5.1.1乙腈（ch3cn）：色谱纯。
5.1.2甲醇（ch3oh）：色谱纯。
5.1.3正己烷（c6h14）：色谱纯。
5.1.4乙酸乙酯（ch3cooch2ch3）：色谱纯。
5.1.5 n，n-二甲基甲酰胺（c3 h7no）：色谱纯。
5.1.6磷酸（h3po4）。
5.1.7磷酸二氢铵（nh4h2po4）。
5.1.8三乙胺[（c2h5）3n]。
5.1.9甲酸（hcooh）。
5.1.10氨水（nh3·h2o）。
5.2标准品
甲苯咪唑（mebendazole，c16h13n3o3，cas号：31431-39-7）、羟基甲苯咪唑（5 -hydroxymebendazole，c16h15n3o3，cas号：60254-95-7）和氨基甲苯咪唑（amino mebendazole，c14h11n3o，cas号：52329-60-9）：含量≥98%。
5.3溶液配制
5.3.1 80%甲醇溶液：取甲醇80 ml，加水至100 ml，混匀。
5.3.2 1%甲酸溶液：取甲酸1 ml，加水至100 ml，混匀。
5.3.3 0.05 mol/l磷酸二氢铵-三乙胺溶液：取磷酸二氢铵5.8 g，加水溶解并稀释至1000 ml，加三乙胺1 ml，混匀。
5.3.4 0.05mol/l磷酸二氢铵缓冲液：取磷酸二氢铵2.9g，加水450ml使溶解，用磷酸调ph至2.0，用水稀释至500 ml。
5.3.5 5%氨化甲醇溶液：取氨水5 ml、甲醇95 ml，混匀；临用前配制。
5.3.6溶解液：取n，n-二甲基甲酰胺150ml，用0.05mol/l磷酸二氢铵缓冲液稀释至500ml。
5.4标准溶液制备
5.4.1标准储备液（100μg/ml）：分别取甲苯咪唑、氨基甲苯咪唑和羟基甲苯咪唑各10 mg，精密称定，加甲酸5ml使其溶解，并用甲醇稀释定容至100ml容量瓶，摇匀，配制成浓度各为10μg/ml的标准储备液。-18℃以下避光保存，有效期6个月。
5.4.2混合标准中间液：分别准确量取甲苯咪唑、氨基甲苯咪唑和羟基甲苯咪唑标准储备液适量，用甲醇稀释配制成含氨基甲苯咪唑5μg/ml、羟基甲苯咪唑2.5μg/ml和甲苯咪唑2.5μg/ml的混合标准中间液。-18℃以下避光保存，有效期3个月。
5.5材料
5.5.1混合型阳离子固相萃取柱：60 mg/3 ml，或相当者。
5.5.2水相聚砜醚针式滤器：0.45μm。
6仪器和设备
6.1高效液相色谱仪，配紫外检测器。
6.2分析天平：感量0.00001 g和0.01 g。
6.3离心机：6 000 r/min。
6.4旋转蒸发仪。
6.5固相萃取装置。
6.6超声波清洗仪。
6.7氮吹仪。
6.8鸡心瓶：100 ml。
7试样的制备与保存
7.1试样的制备
按gb/t 30891-2014中附录b的要求制样。
a）取均质后的供试样品，作为供试试样；
b）取均质后的空白样品，作为空白试样；
c）取均质后的空白样品，添加适宜浓度的混合标准溶液，作为空白添加试样。
7.2试样的保存
-18℃以下保存，有效期3个月。
8测定步骤
8.1提取
取试样3 g（准确至±0.03 g）于50 ml离心管中，加水2 ml，涡旋30 s，使其分散；加乙酸乙酯10 ml，振荡2 min，超声5 min，4 500 r/min离心10 min，乙酸乙酯转入100 ml鸡心瓶。残渣加乙酸乙酯10 ml，按上述方法重复提取2次。合并乙酸乙酯至100 ml鸡心瓶中，40℃旋转蒸发至干。加80%甲醇溶液3 ml，涡旋混合1 min，加正己烷3 ml，混合1 min，将溶液转入10 ml离心管中，6000 r/min离心5 min，去除正己烷层；下层再加正己烷3 ml，重复去脂一次。向下层溶液中加1%甲酸水溶液3 ml，混匀，6 000 r/min离心5 min，上清液备用。
8.2净化
固相萃取柱依次用甲醇、水各3 ml活化，将上清液过柱；依次用水、甲醇各4 ml淋洗，弃去流出液，抽干。用5%氨化甲醇溶液5 ml洗脱，洗脱液接收至10 ml离心管中，40℃氮气吹干。加溶解液1.0ml溶解残余物，涡旋混合1min，用水相针式滤器过滤至进样小瓶中，供高效液相色谱测定。
8.3标准工作曲线的制备
精密量取混合标准中间液适量，用溶解液稀释配制成甲苯咪唑、羟基甲苯咪唑浓度分别为0.02μg/ml、0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml和1.0μg/ml，氨基甲苯咪唑浓度为0. 04μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml和2μg/ml的系列标准工作液，供高效液相色谱测定。分别以甲苯咪唑、氨基甲苯咪唑和羟基甲苯咪唑的峰面积为纵坐标，相应浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。此标准工作液现用现配。
8.4测定
8.4.1液相色谱条件
a）色谱柱：c18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），或相当者；
b）流动相：a为乙腈，b为0. 05 mol/l磷酸二氢铵三乙胺溶液，梯度洗脱条件见表1；
c）流速：0.9 ml/min；
d）柱温：40℃；
e）进样量：30μl；
f）检测波长：289 nm。
8.4.2测定法
取系列标准工作液和试样溶液，作单点或多点校准，按外标法以色谱峰面积定量。标准溶液和试样液中甲苯咪唑、氨基甲苯咪唑和羟基甲苯咪唑的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。在上述色谱条件下，标准溶液液相色谱图见附录a。
8.5空白试验
取空白试料，除不加标准溶液外，采用相同的测定步骤进行平行操作。
9结果计算和表述
试样中甲苯咪唑、氨基甲苯咪唑和羟基甲苯咪唑的残留量按公式（1）计算。
式中：
x——试样中甲苯咪唑或代谢物残留量的数值，单位为微克每千克（μg/kg）；
ci——从标准工作曲线计算得到的试样溶液中甲苯咪唑或代谢物浓度的数值，单位为微克每毫升（μg/ml）；
v——溶解残余物体积的数值，单位为毫升（ml）；
f——稀释倍数；
1 000——换算系数；
m——供试试样质量的数值，单位为克（g）。
10方法灵敏度、准确度和精密度
10.1灵敏度
本方法甲苯咪唑和羟基甲苯咪唑检测限为5μg/kg，定量限为10μg/kg。
本方法氨基甲苯咪唑检测限为10μg/kg；
10.2准确度
本方法甲苯咪唑，羟基甲苯咪唑在10μg/kg~200μg/kg，氨基用苯味唑在20μg/kg~400μg/kg的添加浓度范围内，回收率为70%~100%。
10.3精密度
本方法批内相对标准偏差≤15%，批间相对标准偏差≤15%。
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水产品中甲苯咪唑及代谢物残留量的测定
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1范围
本文件规定了水产品中甲苯咪唑及其代谢物氨基甲苯咪唑羟基甲苯咪唑残留检测的制样和液相色谱测定方法。
本文件适用于鱼、虾和蟹可食组织中甲苯咪唑及其代谢物氨基甲苯咪唑和羟基甲苯咪唑残留量的检测。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性利用而构成本文件必不可（ke）少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件，不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
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3术语和定义
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5试剂和材料
以下所用试剂，除另有注明外均为分析纯、水为符合gb/t 6682规定的一级水。
5.1试剂
5.1.1乙腈（ch3cn）：色谱纯。
5.1.2甲醇（ch3oh）：色谱纯。
5.1.3正己烷（c6h14）：色谱纯。
5.1.4乙酸乙酯（ch3cooch2ch3）：色谱纯。
5.1.5 n，n-二甲基甲酰胺（c3 h7no）：色谱纯。
5.1.6磷酸（h3po4）。
5.1.7磷酸二氢铵（nh4h2po4）。
5.1.8三乙胺[（c2h5）3n]。
5.1.9甲酸（hcooh）。
5.1.10氨水（nh3·h2o）。
5.2标准品
甲苯咪唑（mebendazole，c16h13n3o3，cas号：31431-39-7）、羟基甲苯咪唑（5 -hydroxymebendazole，c16h15n3o3，cas号：60254-95-7）和氨基甲苯咪唑（amino mebendazole，c14h11n3o，cas号：52329-60-9）：含量≥98%。
5.3溶液配制
5.3.1 80%甲醇溶液：取甲醇80 ml，加水至100 ml，混匀。
5.3.2 1%甲酸溶液：取甲酸1 ml，加水至100 ml，混匀。
5.3.3 0.05 mol/l磷酸二氢铵-三乙胺溶液：取磷酸二氢铵5.8 g，加水溶解并稀释至1000 ml，加三乙胺1 ml，混匀。
5.3.4 0.05mol/l磷酸二氢铵缓冲液：取磷酸二氢铵2.9g，加水450ml使溶解，用磷酸调ph至2.0，用水稀释至500 ml。
5.3.5 5%氨化甲醇溶液：取氨水5 ml、甲醇95 ml，混匀；临用前配制。
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5.4标准溶液制备
5.4.1标准储备液（100μg/ml）：分别取甲苯咪唑、氨基甲苯咪唑和羟基甲苯咪唑各10 mg，精密称定，加甲酸5ml使其溶解，并用甲醇稀释定容至100ml容量瓶，摇匀，配制成浓度各为10μg/ml的标准储备液。-18℃以下避光保存，有效期6个月。
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5.5材料
5.5.1混合型阳离子固相萃取柱：60 mg/3 ml，或相当者。
5.5.2水相聚砜醚针式滤器：0.45μm。
6仪器和设备
6.1高效液相色谱仪，配紫外检测器。
6.2分析天平：感量0.00001 g和0.01 g。
6.3离心机：6 000 r/min。
6.4旋转蒸发仪。
6.5固相萃取装置。
6.6超声波清洗仪。
6.7氮吹仪。
6.8鸡心瓶：100 ml。
7试样的制备与保存
7.1试样的制备
按gb/t 30891-2014中附录b的要求制样。
a）取均质后的供试样品，作为供试试样；
b）取均质后的空白样品，作为空白试样；
c）取均质后的空白样品，添加适宜浓度的混合标准溶液，作为空白添加试样。
7.2试样的保存
-18℃以下保存，有效期3个月。
8测定步骤
8.1提取
取试样3 g（准确至±0.03 g）于50 ml离心管中，加水2 ml，涡旋30 s，使其分散；加乙酸乙酯10 ml，振荡2 min，超声5 min，4 500 r/min离心10 min，乙酸乙酯转入100 ml鸡心瓶。残渣加乙酸乙酯10 ml，按上述方法重复提取2次。合并乙酸乙酯至100 ml鸡心瓶中，40℃旋转蒸发至干。加80%甲醇溶液3 ml，涡旋混合1 min，加正己烷3 ml，混合1 min，将溶液转入10 ml离心管中，6000 r/min离心5 min，去除正己烷层；下层再加正己烷3 ml，重复去脂一次。向下层溶液中加1%甲酸水溶液3 ml，混匀，6 000 r/min离心5 min，上清液备用。
8.2净化
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8.3标准工作曲线的制备
精密量取混合标准中间液适量，用溶解液稀释配制成甲苯咪唑、羟基甲苯咪唑浓度分别为0.02μg/ml、0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml和1.0μg/ml，氨基甲苯咪唑浓度为0. 04μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml和2μg/ml的系列标准工作液，供高效液相色谱测定。分别以甲苯咪唑、氨基甲苯咪唑和羟基甲苯咪唑的峰面积为纵坐标，相应浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。此标准工作液现用现配。
8.4测定
8.4.1液相色谱条件
a）色谱柱：c18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），或相当者；
b）流动相：a为乙腈，b为0. 05 mol/l磷酸二氢铵三乙胺溶液，梯度洗脱条件见表1；
c）流速：0.9 ml/min；
d）柱温：40℃；
e）进样量：30μl；
f）检测波长：289 nm。
8.4.2测定法
取系列标准工作液和试样溶液，作单点或多点校准，按外标法以色谱峰面积定量。标准溶液和试样液中甲苯咪唑、氨基甲苯咪唑和羟基甲苯咪唑的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。在上述色谱条件下，标准溶液液相色谱图见附录a。
8.5空白试验
取空白试料，除不加标准溶液外，采用相同的测定步骤进行平行操作。
9结果计算和表述
试样中甲苯咪唑、氨基甲苯咪唑和羟基甲苯咪唑的残留量按公式（1）计算。
式中：
x——试样中甲苯咪唑或代谢物残留量的数值，单位为微克每千克（μg/kg）；
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v——溶解残余物体积的数值，单位为毫升（ml）；
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1 000——换算系数；
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10方法灵敏度、准确度和精密度
10.1灵敏度
本方法甲苯咪唑和羟基甲苯咪唑检测限为5μg/kg，定量限为10μg/kg。
本方法氨基甲苯咪唑检测限为10μg/kg；
10.2准确度
本方法甲苯咪唑，羟基甲苯咪唑在10μg/kg~200μg/kg，氨基用苯味唑在20μg/kg~400μg/kg的添加浓度范围内，回收率为70%~100%。
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