细胞β氨基己糖苷酶（β-hexosaminidase）活性比色法定量检测试剂盒
细胞β氨基己糖苷酶（β-hexosaminidase）活性比色法定量检测试剂盒
产品说明书（中文版）
主要用途
细胞β氨基己糖苷酶（β-hexosaminidase）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过底物pnp-nag受到β氨基己糖苷酶催化水解后，在碱性环境下，呈现黄色，即采用比色法来测定样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物和人体细胞裂解悬液样品中β氨基己糖苷酶的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
技术背景
β氨基己糖苷酶（β-hexosaminidase；ec3.2.1.52）.又称为n-乙酰-β-d-氨基葡萄糖苷酶（n-acetyl--β-d-glucosaminidase；nagase）属于含有20个糖苷水解酶（glycoside hydrolase）家族，也是肽聚糖水解酶，为溶酶体细胞器中的酶之一。其功能在于水解n-乙酰-β-d-氨基己糖苷中的末端n-乙酰-β-d-氨基己糖残基（n-acetyl-d-hexosamineresidues），参与细胞内糖蛋白和糖脂的分解代谢，包括蛋白和中性糖脂中的寡糖、粘多糖等水解。具有宿主抗感染防御作用。β氨基己糖苷酶为同源二聚体结构，有α和β两个亚体构成：hexa和hexb。人体缺乏hexa或hexb，将导致神经退行性相关的疾病，例如家族黑蒙性病（tay-sachs病）和神经节苷脂贮积病 （sandhoff 病）。基于底物4-硝基苯基 n-乙酰-β-d-葡萄糖胺（4-nitrophenyl n-acetyl-β-d-glucosaminide；pnp-nag），在β氨基己糖苷酶的作用下，水解释放出硝基苯酚（p-nitrophenol）和n-乙酰-β-d-葡萄糖胺（n-acetyl-β-d-glucosamine；nag），在碱性环境下，呈现出黄色，在分光光度仪下，产生吸光峰值变化（405nm 波长），来定量分析β氨基己糖苷酶的活性。其反应系统为：
产品内容
缓冲液（reagent a） 毫升
反应液（reagent b） 毫升
碱性液（reagent c） 毫升
阴性液（reagent d） 微升
清理液（reagent e） 毫升
裂解液（reagent f） 毫升
产品说明书 1份
保存方式
保存反应液（reagent b）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月
用户自备
1.5毫升离心管：用于样品操作的容器
15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
细胞刮脱棒：用于细胞脱离
（微型）台式离心机：用于样品操作
比色皿或96孔板：用于比色分析的容器
分光光度仪或酶标仪：用于比色分析
实验步骤
一、样品准备
1．准备好75cm2细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 x 107细胞）
2．小心加入xx毫升清理液（reagent e），覆盖生长表面
3．小心抽去清理液
4．使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）
5．加入xx毫升清理液（reagent e），混匀细胞
6．移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
8．小心抽去上清液
9．加入xx微升裂解液（reagent f），充分混匀
10．转移到预冷的1.5毫升离心管
11．强力涡旋震荡15秒
12．置于冰槽里孵育30分钟
13．放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000rpm，例如eppendorf 5415）
14．小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
15．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）
16．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、测定准备
1．准备好待测样品（例如细胞裂解萃取悬液样品等），置于冰槽里
2．设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长405nm，并置零
3．缓冲液（reagent a）室温下均衡温度
三、背景对照测定
1．移取xx微升缓冲液（reagent a）到新的比色皿
2．加入xx微升反应液（reagent b）
3．加入xx微升阴性液（reagent d）
4．上下倾倒数次，混匀
5．在37℃温度下孵育10分钟
6．加入xx微升碱性液（reagent c）
7．上下倾倒数次，混匀
8．在37℃温度下孵育5分钟
9．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照
四、样品测定
1．移取xx微升缓冲液（reagent a）到新的比色皿
2．加入xx微升反应液（reagent b）
3．加入50微升待测样品（50微克蛋白）（注意：样品须清澈，且ph小于7.5）
4．上下倾倒数次，混匀
5．在37℃温度下孵育10分钟
6．加入xx微升碱性液（reagent c）
7．上下倾倒数次，混匀
8．在37℃温度下孵育5分钟
9．即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数
四、计算样品活性
五、酶标仪测定
1．在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
2．分别移取xx微升缓冲液（reagent a）到相应孔里
3．分别加入xx微升反应液（reagent b）
4．分别加入xx微升阴性液（reagent d）或待测样品（20微克蛋白）（注意：样品须清澈，且ph小于7.5）
5．轻轻摇动96孔板
6．在37℃温度下孵育10分钟
7．分别加入xx微升碱性液（reagent c）
8．轻轻摇动96孔板
9．在37℃温度下孵育5分钟
10．即刻放进酶标仪检测
11．活性计算
注意事项
1．本产品为20次操作，包括背景对照
2．操作时，须戴手套
3．系统操作过程中，背景测定只需1次
4．样品须澄清，至关重要
5．建议使用比色皿测定
6．加样后3秒内比色测定
7．测定值由低到高变化；测定可持续10分钟
8．比色测定后，比色皿须清洗
9．样本测定10分钟读数高于0分钟读数表明具有酶活性
10．建议待测样本蛋白浓度为50微克/50微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量（本公司提供 bradford蛋白质浓度定量试剂盒30030.1）
11．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
12．β氨基己糖苷酶单位活性定义为：在37℃，ph 4.25条件下，每分钟内能够释放1微摩尔硝基苯酚所需的酶量作为一个活性单位
13．本公司提供系列细胞酶学检测试剂产品
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测敏感
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缓冲液（reagent a） 毫升
反应液（reagent b） 毫升
碱性液（reagent c） 毫升
阴性液（reagent d） 微升
清理液（reagent e） 毫升
裂解液（reagent f） 毫升
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保存方式
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用户自备
1.5毫升离心管：用于样品操作的容器
15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
细胞刮脱棒：用于细胞脱离
（微型）台式离心机：用于样品操作
比色皿或96孔板：用于比色分析的容器
分光光度仪或酶标仪：用于比色分析
实验步骤
一、样品准备
1．准备好75cm2细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 x 107细胞）
2．小心加入xx毫升清理液（reagent e），覆盖生长表面
3．小心抽去清理液
4．使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）
5．加入xx毫升清理液（reagent e），混匀细胞
6．移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
8．小心抽去上清液
9．加入xx微升裂解液（reagent f），充分混匀
10．转移到预冷的1.5毫升离心管
11．强力涡旋震荡15秒
12．置于冰槽里孵育30分钟
13．放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000rpm，例如eppendorf 5415）
14．小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
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2．加入xx微升反应液（reagent b）
3．加入xx微升阴性液（reagent d）
4．上下倾倒数次，混匀
5．在37℃温度下孵育10分钟
6．加入xx微升碱性液（reagent c）
7．上下倾倒数次，混匀
8．在37℃温度下孵育5分钟
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1．移取xx微升缓冲液（reagent a）到新的比色皿
2．加入xx微升反应液（reagent b）
3．加入50微升待测样品（50微克蛋白）（注意：样品须清澈，且ph小于7.5）
4．上下倾倒数次，混匀
5．在37℃温度下孵育10分钟
6．加入xx微升碱性液（reagent c）
7．上下倾倒数次，混匀
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四、计算样品活性
五、酶标仪测定
1．在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
2．分别移取xx微升缓冲液（reagent a）到相应孔里
3．分别加入xx微升反应液（reagent b）
4．分别加入xx微升阴性液（reagent d）或待测样品（20微克蛋白）（注意：样品须清澈，且ph小于7.5）
5．轻轻摇动96孔板
6．在37℃温度下孵育10分钟
7．分别加入xx微升碱性液（reagent c）
8．轻轻摇动96孔板
9．在37℃温度下孵育5分钟
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2．操作时，须戴手套
3．系统操作过程中，背景测定只需1次
4．样品须澄清，至关重要
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6．加样后3秒内比色测定
7．测定值由低到高变化；测定可持续10分钟
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10．建议待测样本蛋白浓度为50微克/50微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量（本公司提供 bradford蛋白质浓度定量试剂盒30030.1）
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