医用激光显微镜的应用及荧光探针
医用激光显微镜常用的有fluo-3、rhod-1、indo-1、fura-2等，前两者为单波长激光探针，利用其单波长激发特点可直接测量细胞内ca2+动态变化，为钙定性探针；后两者为双波长激发探针，利用其双波长激发特点和比率技术，能定量细胞内i，为钙定量探针。
定量细胞内[ca2+]i也可用双波长激发探针indo-1和fura-2。由于这些探针须用比率技术，因此又称为钙比率探针。钙比率探针在溶液中均有荧光，测量时须洗去细胞外液探针，而进入细胞后的探针其am被分解后不能透出质膜。由于这些探针要用紫外激发光作激发光源，会造成细胞的损伤，还会增加潜在的自发荧光，而且荧光发射峰波长也较短，须提高发光强度，因而其使用受到一定的限制。
用于医用激光显微镜的主要有acridine orange(吖啶橙，ao)、propidium iodide(化丙啶，pi)。两种染料既可标记dna又可标记rna，如为获得单独的dna或rna分布，染色前可用rna酶或dna酶处理细胞。pi不能进入完整的细胞膜，故不能标记活细胞内的dna和rna。
以往测定膜电位多用微电极直接插入法测量，不仅操作麻烦，而且对细胞也是一种损伤。医用激光显微镜则可利用荧光探针在细胞膜内外分布的差异测出膜电位，不但可以观察细胞膜电位的变化结果，更重要的是可以用于连续监测膜电位的迅速变化。膜电位荧光探针根据其对膜电位变化反应速度的快慢分为快、慢两类探针，各类均有10多种。dibac4(3的膜电位荧光探针，dibac4(3)为带负电荷的阴离子慢反应染料。该探针本身无荧光，当进入细胞与胞浆内的蛋白质结合后才发出荧光，测量时要求细胞浸在荧光染料中。当细胞内荧光强度增加即膜电位增加示细胞去极化；反之，细胞内荧光强度降低即膜电位降低示细胞超极化。rhodamine 123主要用于线粒体膜电位测量。rhodamine123是一种亲脂性阳离子荧光探针，当线粒体膜内侧负电荷增多时，荧光强度增加，与dibac4(3)的表示形式相反。
正常细胞胞浆内的ph一般在6.8～7.4的范围，而某些细胞器如溶酶体的ph则在4.5～6.0之间。根据检测对象ph的不同将荧光探针分为用于偏中性和酸性两类。常用于偏中性ph即细胞胞浆ph检测的荧光探针有snarf类(snarf-1、snarf-calcein)、snafl类(snafl-1、snafl-calcein)、bcecf等，这些探针均为疏水性探针，须使用其am形式。fitc-dextran则适用于ph范围4～6之间，如溶酶体ph的检测，该探针也不能透过质膜，但可通过细胞胞饮作用进入溶酶体，因此应选择分子量稍小的dextran(葡聚糖)。
活性氧(active oxygen species)可影响细胞代谢，与蛋白质、核酸、脂类等发生反应，有些反应是有害的，因此测量活性氧在毒理学研究中有一定的意义。根据检测活性氧的不同可选择不同的荧光探针。常用荧光探针有dichlorodihydrofluorescein diacetate(2，7-二氯二氢荧光素乙酰乙酸、h2dcfda)，其原理是不发荧光的h2dcfda进入细胞后能被存在的过氧化物、过氧化氢等氧化分解为二氯荧光黄（dichlorofluorescein，dcf)而产生荧光，其反应灵敏到10～12 mole水平，荧光强度与活性氧的浓度呈线性关系。
医用激光显微镜可采用荧光光漂白恢复(fluorescence recovery after photobleading，frap)技术检测细胞缝隙连接通讯，该方法的原理是一个细胞内的荧光分子被激光漂白或淬灭，失去发光能力。而临近未被漂白细胞中的荧光分子可通过缝隙连接扩散到已被漂白的细胞中，荧光可以逐渐恢复。由于光漂白过程是不可逆的，因此可通过观察已发生荧光漂白细胞其荧光恢复过程的变化量来判断细胞缝隙连接的通讯功能。采用frap技术检测细胞间通讯常用荧光探针是6-carboxyfluoresceindiacetate(6-羧基荧光黄乙酰乙酸盐、cfda)，需用其酯化形式cfda-am。该技术可用于研究胚胎发生、生殖发育、神经生物学、肿瘤发生等过程中缝隙连接通讯的基本机制和作用。由于某些毒性物质尤其是促癌物可影响缝隙连接介导的物质运输，因此该方法也可用于鉴别对缝隙连接作用有潜在毒性的化学物质。
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活性氧(active oxygen species)可影响细胞代谢，与蛋白质、核酸、脂类等发生反应，有些反应是有害的，因此测量活性氧在毒理学研究中有一定的意义。根据检测活性氧的不同可选择不同的荧光探针。常用荧光探针有dichlorodihydrofluorescein diacetate(2，7-二氯二氢荧光素乙酰乙酸、h2dcfda)，其原理是不发荧光的h2dcfda进入细胞后能被存在的过氧化物、过氧化氢等氧化分解为二氯荧光黄（dichlorofluorescein，dcf)而产生荧光，其反应灵敏到10～12 mole水平，荧光强度与活性氧的浓度呈线性关系。
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