PBMC分离实验介绍
从外周血、骨髓、外周淋巴器官或各种组织分离出来的细胞是多种细胞的混合物。如要研究某种特定细胞的结构、功能或表面标志等特征，首先要分离纯化细胞。细胞分离可根据其大小、密度、表面电荷、吸附能力或表面抗原的差异而采用密度梯度沉降法、贴附、亲和层析、化环形成、补体介导杀伤溶解、免疫磁珠以及流式细胞仪（fcm）等方法来进行纯化。
一．ficoll-hypaque密度梯度离心法分离pbmc原理
常用来分离人外周血单个核细胞（pbmc）的分层液比重是1.077 ± 0.001 kg/l的聚蔗糖（ficoll）-泛影葡胺（urografn）（f /h）分层液。ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，亲水性高，平均分子量为400000。当密度为1.2 g/ml仍未超出止常生理性渗透压，也不透过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中，吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
图1 pbmc分离示意图
二．pbmc分离的实验步骤
1.在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。
2.取肝素抗凝静脉血与等量hanks液或rpmi1640液充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2 000 rpm，20 min。
3.离心后管内分为三层，上层为血浆和hank's液、下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一处以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。
4.用弯头滴管插到云雾层，仔细吸取单个核细胞；也可采用先吸弃上层rpmi 1640和血浆，然后收集富含pbmc的云雾层。将云雾层细胞置人另一短中管中，加人5倍以上体积的hank's液或rpmi 1640，1500 rpm离心10min，洗涤细胞两次。
5.末次离心后，弃上清，加入含有10%小牛血清的rpmi 1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2%台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。单个核细胞浓度（细胞数/1ml细胞悬液）=4个大方格内细胞总数/4×104×2（稀释倍数）。
6.细胞活力检测：死的细胞可被染成蓝色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。活细胞百分率（%）=活细胞数/总细胞数（%）。
7.细胞培养：细胞计数后调整细胞浓度为2×105/ml培养基，加于六孔板或24孔板中进行培养。
8.细胞收集：将六孔板或二十四孔板中的培养基吸出弃掉，每孔加200µl trizol，用移液枪将孔壁吹打数次后，将trizol转入ep管中。
9.细胞冻存：将收集的细胞放入-80℃冰箱中保存。
三．实验过程中的注意事项
1. ficoll应适量，外周血应充分稀释。
2. 温度直接影响到ficoll的比重和分离效果。
3. 在ficoll上加入稀释后的外周血时，应缓慢加，以免冲散界面。
4. 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染。
四．泰克生物羊驼pbmc产品优势
1. 细胞活率高：实验中使用的分离试剂无菌、低内毒素，对细胞无伤害刺激，操作人员具备多年pbmc细胞分离经验，保证细胞的原始状态，分离后的新鲜细胞或冻存复苏后的活率可达90%以上。
2. 产品安全性高、无传染源：严格把控羊驼/骆驼全血来源，保证实验骆驼均经过相关传染源检测，为客户提供更安全、更放心的实验材料。
3. 细胞来源清晰、可溯源：分离羊驼/骆驼使用的全血均由正规动物中心提供采集，具备合规的采购流程以及全血生物安全证书，免除客户使用的后顾之忧。
泰克生物具有成熟的动物pbmc分离技术，保证细胞分离过程中不受损害、不被刺激，后期的纯化技术保证骆驼单个核细胞的纯度以及活率等技术指标，适用于后期的细胞培养、抗体制备等其他研究。
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图1 pbmc分离示意图
二．pbmc分离的实验步骤
1.在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。
2.取肝素抗凝静脉血与等量hanks液或rpmi1640液充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2 000 rpm，20 min。
3.离心后管内分为三层，上层为血浆和hank's液、下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一处以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。
4.用弯头滴管插到云雾层，仔细吸取单个核细胞；也可采用先吸弃上层rpmi 1640和血浆，然后收集富含pbmc的云雾层。将云雾层细胞置人另一短中管中，加人5倍以上体积的hank's液或rpmi 1640，1500 rpm离心10min，洗涤细胞两次。
5.末次离心后，弃上清，加入含有10%小牛血清的rpmi 1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2%台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。单个核细胞浓度（细胞数/1ml细胞悬液）=4个大方格内细胞总数/4×104×2（稀释倍数）。
6.细胞活力检测：死的细胞可被染成蓝色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。活细胞百分率（%）=活细胞数/总细胞数（%）。
7.细胞培养：细胞计数后调整细胞浓度为2×105/ml培养基，加于六孔板或24孔板中进行培养。
8.细胞收集：将六孔板或二十四孔板中的培养基吸出弃掉，每孔加200µl trizol，用移液枪将孔壁吹打数次后，将trizol转入ep管中。
9.细胞冻存：将收集的细胞放入-80℃冰箱中保存。
三．实验过程中的注意事项
1. ficoll应适量，外周血应充分稀释。
2. 温度直接影响到ficoll的比重和分离效果。
3. 在ficoll上加入稀释后的外周血时，应缓慢加，以免冲散界面。
4. 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染。
四．泰克生物羊驼pbmc产品优势
1. 细胞活率高：实验中使用的分离试剂无菌、低内毒素，对细胞无伤害刺激，操作人员具备多年pbmc细胞分离经验，保证细胞的原始状态，分离后的新鲜细胞或冻存复苏后的活率可达90%以上。
2. 产品安全性高、无传染源：严格把控羊驼/骆驼全血来源，保证实验骆驼均经过相关传染源检测，为客户提供更安全、更放心的实验材料。
3. 细胞来源清晰、可溯源：分离羊驼/骆驼使用的全血均由正规动物中心提供采集，具备合规的采购流程以及全血生物安全证书，免除客户使用的后顾之忧。
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