赛默飞Q Exactive HF 实现高通量人 蛋白质组定量分析
关键词 q exactive hf， dda，dia，293t，定量蛋白质组学 数据非依赖性的扫描模式（data-independent acquisition， dia）是近几年来发展的一种新的质谱数据采集方式(1)。 dia 扫描模式中，超高分辨质谱对特定质量范围内的所有 母离子进行碎裂，采集所有母离子的碎片离子，并快速地 依次扫描相邻的母离子窗口内的所有碎片离子。dia 的数 据中包含了所有碎片离子的保留时间和强度信息。用非常 小的质量偏差窗口（如 10 ppm）目标性地抽提同一肽段 的多个子离子，计算子离子的强度，就能对该肽段进行鉴 定和定量。 dia 定量相比传统的基于母离子强度的 dda 定量有选择性好，定量准确等优点，所以 dia 成为定量蛋 白组学新的热门发展方向 (2)。
q exactive hf 是赛默飞世尔科技在 2014 年的 asms 上 推出的全新静电场轨道阱超高分辨质谱仪 (3, 4)。q exactive hf 采 用 了 分 段 式 四 极 杆 技 术（advanced quadrupole technology，aqt）使离子传输效率至少提高了 2 倍；超 高场 orbitrap 技术，提高了 orbitrap 扫描速度，在 15000 分辨率时，二级谱图的扫描速度是 18 hz。这两项技术提 高了 q exactive hf 进行 dda、dia 数据的采集能力。本 文用 q exactive hf 质谱，170 min 色谱梯度对 293t 细胞 蛋白质组进行 dia 定量分析，考察 q exacive hf dia 定 量的能力。
实验条件 实验材料和方法 293t 细胞裂解液酶切肽段，样品中加入 irt 肽段用于保 留时间校正，dda 和 dia 数据采集，每种采集模式平行 进行三次技术重复，dda 用于构建谱图库，dia 用于定量 分析。
nanolc 液相色谱仪：thermo scientific easy-nlc 1000；色 谱柱：analytical column（c18，3 µm，100å，75μm x 20 cm）；流动相：a：0.1% formic acid in water； b：0.1% formic acid in acetonitrile；梯度： 3% - 8% b in 4 min， 8%-30% b in 153 min，30%- 90% b in 10 min，90%- 90% b in 3 min；流速：300 nl/min
质谱分析 dd 模式： 质谱仪：thermo scientific q exactive hf；喷雾电压：2.1 kv；毛细管温度：275 ℃；s-lens：60% ；碰撞能量： 27% hcd；分辨率设置：一级 60,000@m/z 200，二级 15,000@m/z 200；max it ：full ms 20ms，full ms/ms 45 ms；母离子扫描范围：m/z 350-1500；子离子扫描范围： start from m/z 120；data-dependent ms/ms：top 20； isolation window：1.6 da；dynamic exclusion：35s
dia 模式： 质 谱 仪：thermo scientific q exactive hf； 喷 雾 电 压： 2.1 kv；毛细管温度：275 ℃；s-lens：60% ；碰撞能 量：27% hcd；分辨率设置：一级 60,000@m/z 200，二 级 30,000@m/z 200；max it：full ms 20 ms，full ms/ms 45 ms；母离子扫描范围：m/z 350-1200；子离子扫描范围： start from m/z 120；窗口数目：40；隔离窗口：20 da
数据处理 dda 数据采用 proteome discoverer 2.1 进行蛋白鉴定， 数据处理流程：sequest ht 搜库引擎；人蛋白数据库 （uniprot human_201309），母离子质量偏差：10 ppm； 碎片离子质量偏差：0.02 da；固定修饰：半*烷基 化（+57.021 da）；动态修饰：*氧化（+15.995 da）； 酶：trypsin； 漏 切 位 点：2；peptide fdr<0.01； protein fdr<0.01 dia 数据采用 spectronaut (2) 软件进行 dia 蛋白定量：1） 建立谱图库：proteome discoverer 2.1 数据检索生成的 pdresult 文件导入 spectronaut 建立谱图库； 每个肽段 少含有 3 个碎片离子，多含有 6 个碎片离子；碎片离 子的 m/z 范围是 300-1800；2）原始文件格式转化：将 raw 文件格式转换成 htrms 格式的文件；3）dia 数据峰 抽提，导入 dia 数据，设定谱图库，控制 q<0.01。
实验结果 1. dda 鉴定结果以及谱图库建立 取 293t 细胞裂解液酶切肽段约 1 µg 进行 170 min 色谱 梯度的 dda 数据采集，为了获得较全面的谱图库，dda 实验平行进行三次技术重复。3 组 dda 数据用 proteome discoverer 2.1 进行数据检索，控制 peptide fdr<0.01， protein fdr < 0.01，一共鉴定到 90,202 个肽段，6496 个 蛋白，平均一个蛋白鉴定到 15 个肽段，显示 q exactive hf 进行蛋白鉴定实验能获得较好的蛋白序列覆盖率。 将 proteme discoverer 2.1 检索生成的 pdresult 文件导入 spectronaut 建立谱图库，该谱图库格式是 kit 文件，用于 spectronaut dia 峰抽提。在建立谱图库时，筛选每个肽 段至少包含 3 个碎片离子，多包含 6 个碎片离子，碎片 离子的m/z 300-1800。谱图库中一共含有 656,678 个碎 片离子，87,743 个肽段，6,270 个蛋白。
2. dia 定量分析 相同的 293t 样品用于 170 min 色谱梯度的 dia 数据采 集，并且平行进行 3 次技术重复，考察 dia 的定量能力和 cv。图 1 是 3 次 dia 实验的 base peak 图，保留时间和 响应均一致，显示出较好的色谱稳定性。较好的色谱稳定 性是获得可信非标记定量结果的前提。 3 次 dia 实验分别能够抽提到 77,695 个肽段，6,028 个 蛋白；77,673 个肽段，6,042 个蛋白；77,556 个肽段， 6,019 个蛋白（表 1）。dia 能够鉴定到谱图库中 88% 的 肽段，96.7% 的蛋白，显示 dia 具有较高的分析通量。三 次 dia 实验肽段的 median cv 7.5%，蛋白的 median cv 4.3%，显示出 dia 具有非常好的重现性以及定量的准确 性。dia 提峰的质量精度在经过校正后能够达到 3 ppm， 显示 orbitrap 具有较高的质量精度。dia 数据处理的方法 就是对目标肽段的碎片离子进行色谱峰抽提，orbitrap 能 将质量抽提窗口缩小到 3 ppm，那么基于 oribtrap 的 dia 就能获得较好的选择性（图 2）。 tpa（total protein amount）方法可以进行每个蛋白丰度 的估计（5）， 假设总的上样量是 1 µg。通过计算，丰度高的蛋白是 histone h2b type 1-l，柱上浓度是 4631 pmol。丰度低的蛋白是 sister chromatid cohesion protein dcc1，柱上浓度是 6 fmol。丰度低和丰度高的蛋白相差 5 个数量级，显示 orbitrap 具有非常宽的 动态范围。
结论 相叫于传统的 dda 定量，dia 作为新的 label free 定量 方法，具有重现性好、受干扰小、定量准确等优点。通 常 dia 采取 1d lc-ms/ms 的分析方法，因此获得较多 的定量蛋白数目是非常大的挑战。目前文献报道的 dia/ swath 能定量到的人细胞系的蛋白数目在 2000-4000 左 右，远远低于 silac,tmt 等标记定量的通量 (6)。本文基 于新的 q exactive hf 质谱，以 293t 细胞裂解液为模 型考察 dia 定量蛋白的能力。首先对 293t 细胞裂解液酶 切肽段建立谱图库，鉴定到 87743 个肽段，6270 个蛋白， 然后用 dia 对 293t 细胞裂解液酶切跳段进行定量分析。 使用 170 min 的梯度，dia 就能定量到 77000 个肽段， 6000 个蛋白，显示出基于 orbitrap 的 dia 具有非常高的 定量通量
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实验条件 实验材料和方法 293t 细胞裂解液酶切肽段，样品中加入 irt 肽段用于保 留时间校正，dda 和 dia 数据采集，每种采集模式平行 进行三次技术重复，dda 用于构建谱图库，dia 用于定量 分析。
nanolc 液相色谱仪：thermo scientific easy-nlc 1000；色 谱柱：analytical column（c18，3 µm，100å，75μm x 20 cm）；流动相：a：0.1% formic acid in water； b：0.1% formic acid in acetonitrile；梯度： 3% - 8% b in 4 min， 8%-30% b in 153 min，30%- 90% b in 10 min，90%- 90% b in 3 min；流速：300 nl/min
质谱分析 dd 模式： 质谱仪：thermo scientific q exactive hf；喷雾电压：2.1 kv；毛细管温度：275 ℃；s-lens：60% ；碰撞能量： 27% hcd；分辨率设置：一级 60,000@m/z 200，二级 15,000@m/z 200；max it ：full ms 20ms，full ms/ms 45 ms；母离子扫描范围：m/z 350-1500；子离子扫描范围： start from m/z 120；data-dependent ms/ms：top 20； isolation window：1.6 da；dynamic exclusion：35s
dia 模式： 质 谱 仪：thermo scientific q exactive hf； 喷 雾 电 压： 2.1 kv；毛细管温度：275 ℃；s-lens：60% ；碰撞能 量：27% hcd；分辨率设置：一级 60,000@m/z 200，二 级 30,000@m/z 200；max it：full ms 20 ms，full ms/ms 45 ms；母离子扫描范围：m/z 350-1200；子离子扫描范围： start from m/z 120；窗口数目：40；隔离窗口：20 da
数据处理 dda 数据采用 proteome discoverer 2.1 进行蛋白鉴定， 数据处理流程：sequest ht 搜库引擎；人蛋白数据库 （uniprot human_201309），母离子质量偏差：10 ppm； 碎片离子质量偏差：0.02 da；固定修饰：半*烷基 化（+57.021 da）；动态修饰：*氧化（+15.995 da）； 酶：trypsin； 漏 切 位 点：2；peptide fdr<0.01； protein fdr<0.01 dia 数据采用 spectronaut (2) 软件进行 dia 蛋白定量：1） 建立谱图库：proteome discoverer 2.1 数据检索生成的 pdresult 文件导入 spectronaut 建立谱图库； 每个肽段 少含有 3 个碎片离子，多含有 6 个碎片离子；碎片离 子的 m/z 范围是 300-1800；2）原始文件格式转化：将 raw 文件格式转换成 htrms 格式的文件；3）dia 数据峰 抽提，导入 dia 数据，设定谱图库，控制 q<0.01。
实验结果 1. dda 鉴定结果以及谱图库建立 取 293t 细胞裂解液酶切肽段约 1 µg 进行 170 min 色谱 梯度的 dda 数据采集，为了获得较全面的谱图库，dda 实验平行进行三次技术重复。3 组 dda 数据用 proteome discoverer 2.1 进行数据检索，控制 peptide fdr<0.01， protein fdr < 0.01，一共鉴定到 90,202 个肽段，6496 个 蛋白，平均一个蛋白鉴定到 15 个肽段，显示 q exactive hf 进行蛋白鉴定实验能获得较好的蛋白序列覆盖率。 将 proteme discoverer 2.1 检索生成的 pdresult 文件导入 spectronaut 建立谱图库，该谱图库格式是 kit 文件，用于 spectronaut dia 峰抽提。在建立谱图库时，筛选每个肽 段至少包含 3 个碎片离子，多包含 6 个碎片离子，碎片 离子的m/z 300-1800。谱图库中一共含有 656,678 个碎 片离子，87,743 个肽段，6,270 个蛋白。
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