石蜡包埋组织MIRNA提取试剂盒的特点与注意事项！
石蜡包埋组织mirna提取试剂盒的特点与注意事项！
本试剂盒用于快速从福尔马林固定、石蜡包埋组织样品中提取rna包括microrna。的裂解液/蛋白酶k迅速裂解细胞释放出rna，然后裂解混合物通过一个基因组dna清除柱，基因组dna被清除而rna穿透滤过。滤过的rna用乙醇调节结合条件后,rna在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的rnase free h20将纯净rna从硅基质膜上洗脱。得到的rna可用于反转录pcr、荧光定量pcr等实验。
产品组分：
裂解液——————15ml
结合液——————25 ml
漂洗液——————10ml
蛋白酶k——————20mg（可选）
rnase-free h2o——————10ml
基因组dna清除柱和收集管——————50套
rna吸附柱和收集管室温——————50套
产品特点：
1、不使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
2、快速，简捷，单个样品rna提取操作一般可在1小时内完成。
3、试剂盒的基因组清除柱和配方确保有效清除基因组dna残留，一般情况下得到的rna不需要dnase消化，可直接用于反转录pcr、荧光定量pcr等实验。
4、多次柱漂洗确保rna高纯度，可直接用于下游各种实验。
注意事项：
1、所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13000rpm的传统台式离心机，如eppendorf 5415c 或者类似离心机。
2、样品处理量不要超过基因组dna清除柱和rna吸附柱处理能力，否则造成dna残留或者产量降低。不同组织细胞种类rna/dna相差极大，例如胸腺脾脏dna含量丰富，超过5mg就会超过柱子处理能力。cos细胞rna含量丰富，超过3x106细胞就会超过柱子吸附能力。所以开始摸索实验条件时，如果不清楚样品dna/rna含量时宁可使用较少的样品处理量，如不超过2个10μm厚度石蜡切片。将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。
3、裂解液pkd、结合液rbc中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
4、预防rnase 污染，应注意以下几方面：
1)经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致rnase 污染。
2)使用无rnase 的塑料制品和枪头避免交叉污染。
3)rna提取过程中应使用不含rnase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5 m naoh 中浸泡10 分钟，然后用水清洗，再灭菌，即可去除rnase。
4)配制溶液应使用无rnase 的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入depc 至终浓度0.1%( v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌。）
5、关于dna 的微量残留：
一般说来任何总rna 提取试剂在提取过程中无法避免dna 的微量残留（dnase 消化也无法做到无残留），本试剂盒采取了本公司的缓冲体系和基因组dna 清除柱技术，绝大多数dna 已经被清除，可直接用于反转录pcr 和荧光定量pcr。个别特殊情况如dna 含量过于丰富造成残留或者要进行严格的mrna 表达量分析荧光定量pcr，我们建议在进行模板和引物的选择时：
1)选用跨内含子的引物,以穿过mrna 中的连接区,这样dna 就不能作为模板参与扩增反应。
2)选择基因组dna 和cdna 上扩增的产物大小不一样的引物对。
6、rna 纯度及浓度检测：
完整性：rna 可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×tbe 电泳缓冲液；150v，15 分钟)检测完整性。由于石蜡包埋组织福尔马林固定和包埋过程中一般由于rna 与蛋白反应交联会导致rna 断裂或者降解，一般电泳后uv下只能看到模糊弥散（smear）带型，随着储存的时间越长，降解断裂越严重，甚至只能看到峰值仅仅在100bp 左右的模糊条带。这都属于rna 提取正常情况。
纯度：od260/od280 比值是衡量蛋白质污染程度的参考指标。高质量的rna，od260/od280 读数（10mmtris, ph7.5）在1.8-2.1 之间。od260/od280 读数受测定所用溶液的ph 值影响。同一个rna 样品，假定在10mm tris，ph7.5 溶液中测出的od260/od280 读数1.8-2.1 之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间，但这并不表示rna不纯。
浓度：取一定量的rna 提取物，用rnase-free 水稀释n 倍，用rnase-free 水将分光光度计调零，取稀释液进行od260, od280 测定，按照以下公式进行rna浓度的计算：终浓度（ng/μl）= (od260)×(稀释倍数n)×40。
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产品组分：
裂解液——————15ml
结合液——————25 ml
漂洗液——————10ml
蛋白酶k——————20mg（可选）
rnase-free h2o——————10ml
基因组dna清除柱和收集管——————50套
rna吸附柱和收集管室温——————50套
产品特点：
1、不使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
2、快速，简捷，单个样品rna提取操作一般可在1小时内完成。
3、试剂盒的基因组清除柱和配方确保有效清除基因组dna残留，一般情况下得到的rna不需要dnase消化，可直接用于反转录pcr、荧光定量pcr等实验。
4、多次柱漂洗确保rna高纯度，可直接用于下游各种实验。
注意事项：
1、所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13000rpm的传统台式离心机，如eppendorf 5415c 或者类似离心机。
2、样品处理量不要超过基因组dna清除柱和rna吸附柱处理能力，否则造成dna残留或者产量降低。不同组织细胞种类rna/dna相差极大，例如胸腺脾脏dna含量丰富，超过5mg就会超过柱子处理能力。cos细胞rna含量丰富，超过3x106细胞就会超过柱子吸附能力。所以开始摸索实验条件时，如果不清楚样品dna/rna含量时宁可使用较少的样品处理量，如不超过2个10μm厚度石蜡切片。将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。
3、裂解液pkd、结合液rbc中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
4、预防rnase 污染，应注意以下几方面：
1)经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致rnase 污染。
2)使用无rnase 的塑料制品和枪头避免交叉污染。
3)rna提取过程中应使用不含rnase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5 m naoh 中浸泡10 分钟，然后用水清洗，再灭菌，即可去除rnase。
4)配制溶液应使用无rnase 的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入depc 至终浓度0.1%( v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌。）
5、关于dna 的微量残留：
一般说来任何总rna 提取试剂在提取过程中无法避免dna 的微量残留（dnase 消化也无法做到无残留），本试剂盒采取了本公司的缓冲体系和基因组dna 清除柱技术，绝大多数dna 已经被清除，可直接用于反转录pcr 和荧光定量pcr。个别特殊情况如dna 含量过于丰富造成残留或者要进行严格的mrna 表达量分析荧光定量pcr，我们建议在进行模板和引物的选择时：
1)选用跨内含子的引物,以穿过mrna 中的连接区,这样dna 就不能作为模板参与扩增反应。
2)选择基因组dna 和cdna 上扩增的产物大小不一样的引物对。
6、rna 纯度及浓度检测：
完整性：rna 可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×tbe 电泳缓冲液；150v，15 分钟)检测完整性。由于石蜡包埋组织福尔马林固定和包埋过程中一般由于rna 与蛋白反应交联会导致rna 断裂或者降解，一般电泳后uv下只能看到模糊弥散（smear）带型，随着储存的时间越长，降解断裂越严重，甚至只能看到峰值仅仅在100bp 左右的模糊条带。这都属于rna 提取正常情况。
纯度：od260/od280 比值是衡量蛋白质污染程度的参考指标。高质量的rna，od260/od280 读数（10mmtris, ph7.5）在1.8-2.1 之间。od260/od280 读数受测定所用溶液的ph 值影响。同一个rna 样品，假定在10mm tris，ph7.5 溶液中测出的od260/od280 读数1.8-2.1 之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间，但这并不表示rna不纯。
浓度：取一定量的rna 提取物，用rnase-free 水稀释n 倍，用rnase-free 水将分光光度计调零，取稀释液进行od260, od280 测定，按照以下公式进行rna浓度的计算：终浓度（ng/μl）= (od260)×(稀释倍数n)×40。
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