ELISA技术综述（五）
其他内容：
酶联免疫测定技术的多酶级联放大系统：
一、ap底物放大系统
substrate ampiification system
ap可催化底物nadp+脱磷酸而生成nad+(辅酶1)，以乙醇作还原剂，在醇脱氧酶催比下，乙醇脱氢，nad+还原为nadh，nadh在黄递酶的催 化下脱氢，同时四唑盐(tetrazoliim)被还原成有色的甲蜡(formazan)。ap不断催化nad+生成，nad+与nadh循环转化，不断 生成甲蜡。整个反应周期由ap及醇脱氢酶、黄递酶组成酶级联，每个ap分子每分钟可催化生成6x104个nad+分子，而每个nad+每分钟又可使60个 甲腊分子产生。这种由selfl984年shou次报道的eia放大系统可使eia的测定敏感性提高约250倍。
但brooks等发现上述底物反应循环中产生的乙醛对整个酶级联反应有抑制作用，影响放大效果，而当加入盐酸氨基脲时，则可进一步延长反应循环，从而增加 测定敏感性，这是因为盐骏氨基脲可与乙醛反应生成缩氨基脲(semicarbatone)和水，这样就消除了乙醛对反应的抑制阼用。应用这种改进方法测定 食物中含蛋白a的金黄色葡萄球菌，测定敏感性从self原方法的(4～6)x103菌落形成单位(c．{．u)/g或m1，到20个菌落形成单位 (c．f．u)/g或ml，测定敏惑性约提高200—300倍。
后来self等又用刃天青(resazurin)代替其原来放大模式中的四唑盐，刃天青在黄递酶的作用下成为发出荧光的resorufin，然后使用荧光比色计测定得到结果。这种方式的测定敏感性也较原始方法大为提高，每孔内仅含约350个ap分子也可测出。
二、双酶级联放大系统
dual-enzyme cascade双酶级联放大系统又称酶抑制级联放大系统，酯酶抑制剂4—(3—氧—4，4，4—三氟丁基)苯磷骏盐因其带有封闭性—p04基团，对酯酶不具抑制活性，但 当其在ap作用下脱—po4基时，失活的抑制剂即成为具活性的抑制剂，使加入的羧酸酯酶失活，通过显色反应测定残留的酯酶活性即可知原始ap的活性，二者 成反比相关。这种放大系统的测定敏感性较普通方法可提高约125倍。
三、酶激活级联放大系统
enzymeactivationcascade这亦是一种以ap为标记酶的放大系统。黄素—腺嘌呤二核苷酸磷酸(fadp)在ap的催化下脱磷酸为fad，fad则使脱辅基的氨基酸氧化酶转化为全酶的 氨基酸氧化酶，后者催化晡氨酸生成h2o2，于是在dchbs，4aap及hrp存在下，得到有色产物。上述放大系统可测定l{mol/lap。
此外，催化指示物沉着(catalyzedreporterdeposition，card)也是一种多酶级联eia放大系统。hrp氧化生物素或荧光素 标记的酪胺所产生的游离基，可与固相上蛋白的酪氨酸、色氨酸反应而使大量的生物素或荧光素沉着于固相上hrp周围的区域内，沉着的生物素可用hrp及6— 半乳糖苷酶或ap标记的链霉亲合素测定，沉着的荧光素则可用酶标抗荧光素测定。这样使得一分子hrp转化为大量的标记物，从而大为改善(约30倍)eia 的测定敏感性。diamandis等使用螯合的eu3+链霉亲合素—甲状腺球蛋白试剂替代上述酶标物测定afp，不但提高了测定敏感性，而且也使背景“噪 声”较普通方法改善了6～8倍。我们将上述card放大系统直接用于hbsag商品elisa试剂盒，在不改变商品试剂盒任何成分和操作步骤的情况下，可 将试剂盒的测定敏感性提高约5倍。
四、凝固因子酶级联放大系统
脂多糖(1ipopolysaccharide，lps)可激活鲎血细胞裂解物的凝固级联反应。首先lps使因子c激活为c，后者又激活因子b为b，b使 前凝固酶转化为凝固酶，凝固酶则催化底物(boc-le，u-gly-arg-p)产生有色的对硝基苯胺(旷 nitroa·niline，pna)，a405nm测定。因此，在免疫测定中，如以lps作为标记物标记抗体，则可通过上述反应使测定敏感性放大，可检 出10-7～10-11g／m1的igg和10-7～10-11g／ml的抗igg，seki等将上述方法用于双夹心法检测hbsag，敏感性达 10-10～10-12g／ml。
五、免疫复合物转移两位点酶免疫试验
一般来说，在酶免疫测定中，限制测定敏感性的一个重要因素是非特异地结合于固相的标记酶的显色反应，因其会使背景显色加深，从而掩盖了低浓度待测物所致的 特异显色，解决这个问题提高测定敏感性的一条途径是将待测物——抗体—酶复合物从固相上洗提至另一个固相，使用一双标抗体[如生物素和二硝基苯(dnp) 标记的抗体]和一酶标抗体即可达到这个目的，在液相中形成的免疫复合物(双标抗体：抗原：抗体：酶)捕获于dnpigg包被的聚苯烯珠上，洗涤后，使用二 硝基苯—l—赖氨酸将其从固相上取代下来，然后再将上述免疫复合物捕获于链霉亲合素包被的聚苯烯珠上，最后进行酶反应显色测定。hashida和 shikawa使用该方法测铁蛋白敏感性达到1zeptomole(1x10-21mol，约600个分子)，较常规方法提高了30倍。众多的研究者用该 方法测定抗甲状腺球蛋白igc及抗htlv—1 igg和抗hiv-1 igg，敏感性均远远地超过常规方法，取得了良好的效果。
此外，domingo和marco等在进行点免疫结合试验时，以4—氯—1—萘酚作为hrp的底物，反应后得到的不可溶产物因其具有特殊的紫外吸收及荧光 幻灭特征而可在紫外灯下观察结果。由于沉着于膜上的物质是hrp反应的中间产物，而非可见光下能见到的最终产物，所以可大幅度地提高这种固相免疫测定的敏 感性，较常规方法约增加100倍。至于酶脂质体放大系统(1iposomeamplificat*tem)，也是一种新型高效的eia测定放大 系统。
综上所述，eia测定放大方式虽然多种多样，且不断推陈出新，但研究者的出发点无非是一方面极力降低影响测定敏感性的非特异显色，如通过 增加操作步骤而达到上述目的的免疫复合物转移两位点酶免疫试验；另一方面则是通过质量提高的信号，从而达到提高敏感性的目的，如增加反应层次的生物素—亲 合素，多酶级联等放大系统。但严格地讲，真正称得上是eia测定放大系统的仅限于后者，前者还只能说是一种所谓的超敏感 eia(uhrasensitive enzyme immunoassay)。至于利用酶反应产物特征改变检测手段(如发光或荧光检测)而使eia测定敏感性提高，则只不过是依靠仪器开阔了“视野“而已。
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但brooks等发现上述底物反应循环中产生的乙醛对整个酶级联反应有抑制作用，影响放大效果，而当加入盐酸氨基脲时，则可进一步延长反应循环，从而增加 测定敏感性，这是因为盐骏氨基脲可与乙醛反应生成缩氨基脲(semicarbatone)和水，这样就消除了乙醛对反应的抑制阼用。应用这种改进方法测定 食物中含蛋白a的金黄色葡萄球菌，测定敏感性从self原方法的(4～6)x103菌落形成单位(c．{．u)/g或m1，到20个菌落形成单位 (c．f．u)/g或ml，测定敏惑性约提高200—300倍。
后来self等又用刃天青(resazurin)代替其原来放大模式中的四唑盐，刃天青在黄递酶的作用下成为发出荧光的resorufin，然后使用荧光比色计测定得到结果。这种方式的测定敏感性也较原始方法大为提高，每孔内仅含约350个ap分子也可测出。
二、双酶级联放大系统
dual-enzyme cascade双酶级联放大系统又称酶抑制级联放大系统，酯酶抑制剂4—(3—氧—4，4，4—三氟丁基)苯磷骏盐因其带有封闭性—p04基团，对酯酶不具抑制活性，但 当其在ap作用下脱—po4基时，失活的抑制剂即成为具活性的抑制剂，使加入的羧酸酯酶失活，通过显色反应测定残留的酯酶活性即可知原始ap的活性，二者 成反比相关。这种放大系统的测定敏感性较普通方法可提高约125倍。
三、酶激活级联放大系统
enzymeactivationcascade这亦是一种以ap为标记酶的放大系统。黄素—腺嘌呤二核苷酸磷酸(fadp)在ap的催化下脱磷酸为fad，fad则使脱辅基的氨基酸氧化酶转化为全酶的 氨基酸氧化酶，后者催化晡氨酸生成h2o2，于是在dchbs，4aap及hrp存在下，得到有色产物。上述放大系统可测定l{mol/lap。
此外，催化指示物沉着(catalyzedreporterdeposition，card)也是一种多酶级联eia放大系统。hrp氧化生物素或荧光素 标记的酪胺所产生的游离基，可与固相上蛋白的酪氨酸、色氨酸反应而使大量的生物素或荧光素沉着于固相上hrp周围的区域内，沉着的生物素可用hrp及6— 半乳糖苷酶或ap标记的链霉亲合素测定，沉着的荧光素则可用酶标抗荧光素测定。这样使得一分子hrp转化为大量的标记物，从而大为改善(约30倍)eia 的测定敏感性。diamandis等使用螯合的eu3+链霉亲合素—甲状腺球蛋白试剂替代上述酶标物测定afp，不但提高了测定敏感性，而且也使背景“噪 声”较普通方法改善了6～8倍。我们将上述card放大系统直接用于hbsag商品elisa试剂盒，在不改变商品试剂盒任何成分和操作步骤的情况下，可 将试剂盒的测定敏感性提高约5倍。
四、凝固因子酶级联放大系统
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此外，domingo和marco等在进行点免疫结合试验时，以4—氯—1—萘酚作为hrp的底物，反应后得到的不可溶产物因其具有特殊的紫外吸收及荧光 幻灭特征而可在紫外灯下观察结果。由于沉着于膜上的物质是hrp反应的中间产物，而非可见光下能见到的最终产物，所以可大幅度地提高这种固相免疫测定的敏 感性，较常规方法约增加100倍。至于酶脂质体放大系统(1iposomeamplificat*tem)，也是一种新型高效的eia测定放大 系统。
综上所述，eia测定放大方式虽然多种多样，且不断推陈出新，但研究者的出发点无非是一方面极力降低影响测定敏感性的非特异显色，如通过 增加操作步骤而达到上述目的的免疫复合物转移两位点酶免疫试验；另一方面则是通过质量提高的信号，从而达到提高敏感性的目的，如增加反应层次的生物素—亲 合素，多酶级联等放大系统。但严格地讲，真正称得上是eia测定放大系统的仅限于后者，前者还只能说是一种所谓的超敏感 eia(uhrasensitive enzyme immunoassay)。至于利用酶反应产物特征改变检测手段(如发光或荧光检测)而使eia测定敏感性提高，则只不过是依靠仪器开阔了“视野“而已。
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