细胞活力检测方法大盘点，CTG 法放大招？- MCE
细胞活力检测产品大 pk
常用的细胞活力检测试剂主要有 mtt、cck8等检测方法(图 1)。
mtt法：又称 mtt 比色法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 mtt 还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲臜 (formazan) 并沉积在细胞中，但死细胞无此功能，后经 dmso 溶解，于 490 nm 处测定吸光值便可间接反应细胞活力。但该方法除去操作步骤耗时以外，生成的 formazan 是不溶于水的，需经 dmso 溶解后才能检测，增加了工作量的同时仍不能保证测定结果的准确性，且该溶剂对人体具有明显毒性。
cck8法：相较于 mtt，无论是操作步骤还是检测时间都优化了很多。cck8 是一种基于 wst-8 而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度、无放射性的比色检测方法(可看往期推文 cck-8，让细胞活性检测 so easy!)。但在实验时，一直有个问题让人很困扰——“细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅”，但这个颜色深浅的标准我 “标” 不出来怎么办？痛点！痛点！痛点！
科研汪 ：mtt 作为“元老”级别的检测方法，虽然“老练”，paper 无数，但麻烦是真麻烦，cck8 法倒是便捷很多！
小 m：那你是还没用过更便捷的...
科研汪 ：莫非你说的是细胞活力检测的“金标准”？
小 m：ctg 细胞活力检测，简单、灵敏、快速的均质检测方法，反应 10 分钟即可得到“bling bling”的检测结果，你就说“快不快”？
ctg发光法：基于高灵敏度生物发光检测技术，通过对三磷酸腺苷 (atp) 进行定量以测定培养物中活细胞数目及细胞活力。该实验方法可用三个字简单概括 “快、准、狠”，比 mtt 的处理速度快近 20 倍，节省时间近 4 小时。ctg *的均质检测法即 “加样-混样-检测”，使用时，只需将本试剂等体积添加至培养细胞中即可进行检测。不用感慨，细胞活力检测为什么不能如此简单？
图 1. mtt、cck8 与 ctg 法的实验流程图
表 1. mtt、cck8 与 ctg 法特点比较
ctg，适用于哪些实验
首先，来了解实验ctg 发光法的测定原理：atp 作为细胞新陈代谢的一个重要指标，与活细胞数目呈良好的线性关系，是细胞活力检测的重要标志性分子。atp 生物发光的原理为：荧光素酶以荧光素、atp 和 o2 为底物，在 mg2+存在时，可将化学能转化为光能；在荧光素酶催化的发光反应中，atp 在一定的浓度范围内，其浓度与发光强度呈线性关系，即在光信号与酶反应体系中，发光值与 atp 呈正比，atp 与活细胞数成正比，ctg 发光法通过 atp 含量来进行细胞计数或活力测定，且不受化合物自发荧光的影响 (图 2)，是细胞增殖测定，细胞活力测定和细胞毒性高通量筛选分析的理想选择。
图 2. ctg 法检测原理
■案例 1：细胞增殖测定
如图 3 所示，为了探究 sipl1 对 tnbc 细胞增殖的影响，将 sipl1 表达载体转染至 bt-549 与 mda-mb-231 细胞， 并使用 cck8 法与 ctg 法，进行细胞增殖检测。cck-8 检测：tnbc 细胞瞬时转染 shrna 或过表达质粒并培养 24 h 后检测。
ctg 发光细胞活力测定：tnbc 细胞在 37°c 下培养过夜。然后，将 100 µl ctg 溶液直接与培养基混合，在室温下培养 20 分钟。结果显示，转染靶向 sipl1 shrnas 的 bt-549 和 mda-mb-231 细胞系的细胞增殖显著降低(图 3)。
图 3. sipl1 对 tnbc 细胞活力的影响[1]
cck-8 (a) 和 ctg发光细胞活力测定 (b) 用指示载体转导 bt-549 和
mda-mb-231 细胞增殖能力的分析。
■案例 2：细胞活力测定如图 4 所示，为了探究外源 rrm2 是否会影响肝癌细胞的铁死亡，在 hepg2 和 smmc-7721 细胞中过表达或敲除 rrm2，通过 ctg 法检测其对细胞活力的影响。结果表明，过表达 rrm2 时，细胞活力明显增强，反之，敲除rrm2时，细胞活力明显降低[1]。
图 4. 通过 ctg 法测定 rrm2 对细胞活力的影响[2]
(a) 在体外表达或敲除 rrm2 的 hepg2 和 smmc-7721 细胞中测量细胞死亡 (b) 和 4-hne 水平 (c)，然后再用 fer-1、zvad-fmk、nec-1 或体外表达的 rrm2 进行进一步处理。细胞活力测定采用 ctg 发光细胞活力测定法。
■案例 3：细胞毒性高通量筛选分析如下图所示，作者团队报告了一种基于浓度-反应曲线的表型定量高通量筛选 (qhts)，旨在识别对疟原虫肝脏和无性血期寄生虫具有活性的化合物(图5)。使用 sybr green 或荧光素酶来测试对寄生虫生长的抑制，共检测了 456,817 种化合物。
在 qhts 之后，又分类选择了 4,253 种合成易处理的化合物，用于验证抗疟原虫活性和哺乳动物毒性。在 3 μm 和 1 μm 浓度下对化合物进行体外抗伯氏疟原虫肝期寄生虫的评估。其中使用 ctg 法评估了所有 4,253 种化合物对 hepg2 的细胞毒性。其中 255 种化合物对 hepg2 细胞表现出一定程度的生长细胞毒性，ac50 值 < 43 µm (随后被排除)。最终筛选出 994 种经过验证的无毒性化合物，用于针对肝阶段寄生虫的后续评估。
图 5.针对恶性疟原虫无性血期寄生虫的定量高通量筛选[3]。
ctg “得宠” 理由汇总图 6. mce ctg cell viability detection reagent 与同类产品（竞品）对比测试结果a. 产品发光稳定性测试（293t 细胞)；b. 不同细胞数的线性范围比较 (293t 细胞)；c. 不同细胞系的检测结果比较 (293t、h4iie、jurkat 细胞)对比测试结果表明：持续 3 h 的生物发光稳定性的检测中，mce ctg cell viability detection reagent 的发光信号值比较稳定 (图 5a)；不同细胞数的线性范围中，mce 产品线性关系良好，与进口 竞品线性几乎一致 (图 5b)；且对于不同细胞系，mce 产品与进口竞品检测信号值相当 (图5c)。综上检测结果表明，mce ctg 试剂盒可实现稳定、灵敏、批次间差异较小的不同细胞系的细胞活力检测。
表 2. mce ctg cell viability detection reagent 产品特性
靠谱的细胞活力 ctg 检测试剂，尊贵的 vip 客户体验，想发 sci 深梦呓语的心。无需按捺您的“蠢蠢欲动”，小 m 早已备好你想要的试用装 (试用装链接)。体验不收费，时间最宝贵~ 快快申领吧！
实验小 tips，附上 ctg 使用注意事项，希望你能早日发 sci 啦。
1. 荧光素酶的活性对温度较为敏感，反复冻融会致其逐渐失活，建议分装冻存，避免反复冻融。冻融时，可能会导致试剂中出现少量沉淀，可平衡至室温后观测沉淀溶解情况，如仍有残留，可离心后去除。
2. 本产品在使用或分装时所使用耗材应注意避免 atp 污染。
3. 若待测药物的溶剂含量较高，荧光素酶反应可能会被干扰，致化学发光信号受到影响，可设置含有溶剂的细胞培养液的对照孔以排除此干扰。
4. 检测时需使用适合于细胞培养的白色或黑色的多孔板 (96 孔板或 384 孔板)，普通透明多孔板的相邻孔之间可能会产生相互干扰。如使用透明板，可使用不透明的白色胶带粘贴孔底。
5. 建议在避光环境下进行荧光检测。
6. 由于整个发光反应非常迅速，建议加入 ctg 试剂孵育 10 分钟后，立即检测荧光。
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cell counting kit-8
cell counting kit-8，简称 cck-8 试剂盒或 cck8 试剂盒，是一种基于 wst-8 而广泛应用于细胞活性和细胞毒性检测的快速、高灵敏度试剂盒。
ctg cell viability detection reagent
mce ctg 发光法细胞活力检测试剂盒基于高灵敏度生物发光检测技术，通过对 atp 进行定量以测定培养物中活细胞数目及细胞活力。
cytotoxicity ldh assay kit
mce ldh assay kit 是通过分析释放到培养上清液中的 ldh 活性而测定细胞损伤的试剂盒。配合使用 cck-8 (cat.: no. hy-k0301) 可获得死细胞、活细胞数据。
mce 的所有产品仅用作科学研究或药证申报，我们不为任何个人用途提供产品和服务参考文献
1. juanjuan he, jing wang, et al. sipl1, regulated by maz, promotes tumor progression and predicts poor survival in human triple-negative breast cancer. front oncol. 2021 dec 17;11:766790.
2. yueyue yang, jiafei lin, susu guo, et al. rrm2 protects against ferroptosis and is a tumor biomarker for liver cancer. cancer cell int. 2020 dec 7;20(1):587.
3. dorjbal dorjsuren, richard t eastman, et al. chemoprotective antimalarials identified through quantitative high-throughput screening of plasmodium blood and liver stage parasites.sci rep. 2021 jan 22;11(1):2121.
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常用的细胞活力检测试剂主要有 mtt、cck8等检测方法(图 1)。
mtt法：又称 mtt 比色法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 mtt 还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲臜 (formazan) 并沉积在细胞中，但死细胞无此功能，后经 dmso 溶解，于 490 nm 处测定吸光值便可间接反应细胞活力。但该方法除去操作步骤耗时以外，生成的 formazan 是不溶于水的，需经 dmso 溶解后才能检测，增加了工作量的同时仍不能保证测定结果的准确性，且该溶剂对人体具有明显毒性。
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图 1. mtt、cck8 与 ctg 法的实验流程图
表 1. mtt、cck8 与 ctg 法特点比较
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首先，来了解实验ctg 发光法的测定原理：atp 作为细胞新陈代谢的一个重要指标，与活细胞数目呈良好的线性关系，是细胞活力检测的重要标志性分子。atp 生物发光的原理为：荧光素酶以荧光素、atp 和 o2 为底物，在 mg2+存在时，可将化学能转化为光能；在荧光素酶催化的发光反应中，atp 在一定的浓度范围内，其浓度与发光强度呈线性关系，即在光信号与酶反应体系中，发光值与 atp 呈正比，atp 与活细胞数成正比，ctg 发光法通过 atp 含量来进行细胞计数或活力测定，且不受化合物自发荧光的影响 (图 2)，是细胞增殖测定，细胞活力测定和细胞毒性高通量筛选分析的理想选择。
图 2. ctg 法检测原理
■案例 1：细胞增殖测定
如图 3 所示，为了探究 sipl1 对 tnbc 细胞增殖的影响，将 sipl1 表达载体转染至 bt-549 与 mda-mb-231 细胞， 并使用 cck8 法与 ctg 法，进行细胞增殖检测。cck-8 检测：tnbc 细胞瞬时转染 shrna 或过表达质粒并培养 24 h 后检测。
ctg 发光细胞活力测定：tnbc 细胞在 37°c 下培养过夜。然后，将 100 µl ctg 溶液直接与培养基混合，在室温下培养 20 分钟。结果显示，转染靶向 sipl1 shrnas 的 bt-549 和 mda-mb-231 细胞系的细胞增殖显著降低(图 3)。
图 3. sipl1 对 tnbc 细胞活力的影响[1]
cck-8 (a) 和 ctg发光细胞活力测定 (b) 用指示载体转导 bt-549 和
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■案例 2：细胞活力测定如图 4 所示，为了探究外源 rrm2 是否会影响肝癌细胞的铁死亡，在 hepg2 和 smmc-7721 细胞中过表达或敲除 rrm2，通过 ctg 法检测其对细胞活力的影响。结果表明，过表达 rrm2 时，细胞活力明显增强，反之，敲除rrm2时，细胞活力明显降低[1]。
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(a) 在体外表达或敲除 rrm2 的 hepg2 和 smmc-7721 细胞中测量细胞死亡 (b) 和 4-hne 水平 (c)，然后再用 fer-1、zvad-fmk、nec-1 或体外表达的 rrm2 进行进一步处理。细胞活力测定采用 ctg 发光细胞活力测定法。
■案例 3：细胞毒性高通量筛选分析如下图所示，作者团队报告了一种基于浓度-反应曲线的表型定量高通量筛选 (qhts)，旨在识别对疟原虫肝脏和无性血期寄生虫具有活性的化合物(图5)。使用 sybr green 或荧光素酶来测试对寄生虫生长的抑制，共检测了 456,817 种化合物。
在 qhts 之后，又分类选择了 4,253 种合成易处理的化合物，用于验证抗疟原虫活性和哺乳动物毒性。在 3 μm 和 1 μm 浓度下对化合物进行体外抗伯氏疟原虫肝期寄生虫的评估。其中使用 ctg 法评估了所有 4,253 种化合物对 hepg2 的细胞毒性。其中 255 种化合物对 hepg2 细胞表现出一定程度的生长细胞毒性，ac50 值 < 43 µm (随后被排除)。最终筛选出 994 种经过验证的无毒性化合物，用于针对肝阶段寄生虫的后续评估。
图 5.针对恶性疟原虫无性血期寄生虫的定量高通量筛选[3]。
ctg “得宠” 理由汇总图 6. mce ctg cell viability detection reagent 与同类产品（竞品）对比测试结果a. 产品发光稳定性测试（293t 细胞)；b. 不同细胞数的线性范围比较 (293t 细胞)；c. 不同细胞系的检测结果比较 (293t、h4iie、jurkat 细胞)对比测试结果表明：持续 3 h 的生物发光稳定性的检测中，mce ctg cell viability detection reagent 的发光信号值比较稳定 (图 5a)；不同细胞数的线性范围中，mce 产品线性关系良好，与进口 竞品线性几乎一致 (图 5b)；且对于不同细胞系，mce 产品与进口竞品检测信号值相当 (图5c)。综上检测结果表明，mce ctg 试剂盒可实现稳定、灵敏、批次间差异较小的不同细胞系的细胞活力检测。
表 2. mce ctg cell viability detection reagent 产品特性
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1. 荧光素酶的活性对温度较为敏感，反复冻融会致其逐渐失活，建议分装冻存，避免反复冻融。冻融时，可能会导致试剂中出现少量沉淀，可平衡至室温后观测沉淀溶解情况，如仍有残留，可离心后去除。
2. 本产品在使用或分装时所使用耗材应注意避免 atp 污染。
3. 若待测药物的溶剂含量较高，荧光素酶反应可能会被干扰，致化学发光信号受到影响，可设置含有溶剂的细胞培养液的对照孔以排除此干扰。
4. 检测时需使用适合于细胞培养的白色或黑色的多孔板 (96 孔板或 384 孔板)，普通透明多孔板的相邻孔之间可能会产生相互干扰。如使用透明板，可使用不透明的白色胶带粘贴孔底。
5. 建议在避光环境下进行荧光检测。
6. 由于整个发光反应非常迅速，建议加入 ctg 试剂孵育 10 分钟后，立即检测荧光。
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1. juanjuan he, jing wang, et al. sipl1, regulated by maz, promotes tumor progression and predicts poor survival in human triple-negative breast cancer. front oncol. 2021 dec 17;11:766790.
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