基于Orbitrap ID-X技术的中药柴胡体外肠内菌代谢物分析
前言：传统中药以口服用药为主，其化学成分受胃肠道酸碱性、肠道微生 物及代谢酶等影响常发生转化，使其生物利用度降低，体内除中药 原形成分外，还可能有大量代谢产物的存在，这些体内吸收化学 成分是阐明中药发挥药效机制的直接物质基础。要想揭示中药体内 药效物质，代谢产物研究是*的重要组成部分，尤其是苷类 及其他结构易转化的化学成分（如萜类等），其生物利用度较低， 在体内主要以代谢产物的形式存在，在此种情况下，代谢产物可能 是药效的主要来源[1]。然而，由于中药成分的代谢规律不明 确、代谢产物含量低难以鉴定等原因，大大制约了中药体内药效物 质基础的研究。
为了更加深入的研究中药体内药效物质基础，需要利用高分辨质谱 对中药体内代谢物进行更深度的鉴定分析。然而由于中药体内的代 谢物通常含量很低，且同时受到基质背景的干扰，传统lc q-tof ms高分辨质谱的dda数据采集模式难以获得低含量代谢物的二级 质谱图用于结构鉴定。新一代赛默飞orbitrap id-x tribrid三合一质谱仪由 于具有acquire x智能化数据采集模式，自动迭代生成排除列表及 包含列表，可以获得极低含量组分的多级质谱用于代谢物的深度分 析。
柴胡bupleuri radix为伞形科植物柴胡（又称北柴胡）bulpeurum chinese dc. 和狭叶柴胡（又称南柴胡）bulpeurum scorzonerifolium willd的干燥根，其性味苦凉、微寒，具有解表和里、疏肝解 郁、升举阳气之功效[2]。柴胡化学成分复杂，其中皂苷类、挥发油 类、黄酮类为柴胡的主要活性成分，具有免疫调节、抗抑郁、保 肝、抗肿瘤、解热抗炎等药理作用[3-5]。近年来，液相色谱-质谱联 用技术（lc-ms）的成熟与发展已被应用于柴胡皂苷类组分的代谢研究[6,7]。然而，单个活性组分的代谢研究以及部分代谢物的鉴定结 果仍然无法全面综合的评价柴胡的质量和体内药效物质基础。
本实验采用离体实验的代谢研究方法，通过具有acquirex采集功能 的orbitrap id-x tribrid ms技术对柴胡代谢产物进行整体分析。首先 用富含肠内菌的粪便悬浮液与柴胡提取物在厌氧条件下温孵，利用 compound discoverer 3.0代谢物分析软件对采集的高分辨质谱数 据进行解析，终构建柴胡的肠内菌代谢指纹图，以期为中药的临 床合理应用奠定理论基础。
实验方法
1. 样品前处理 取柴胡粉末约20g，加入150ml 70%乙醇置于圆底烧瓶中，加热 回流提取60min，离心后取上清液，抽滤后滤液旋转蒸发浓缩至20 ml，冻干保存。肠内菌液的收集与制备参考文献[8]，培养时间分 别为0小时（对照组），1小时和24小时作为实验组样品。用等量 的磷酸钾缓冲溶液代替底物溶液，其它操作同实验组，此作为空白 组。
2. 色谱方法 超高效液相uhplc（dionex ultimate 3000，thermo fisher scientific）系统进行色谱分离，该系统由真空脱气机，自动进样器，柱 温箱，和二元泵组成。色谱柱为hypersil gold c18（2.1 mm × 100 mm，1.9μm，thermo fisher scientic）；流动相为0.1％甲酸水 （a）和乙腈100%（b）。流速为0.3ml / min，进样体积3ul， 柱温40℃；采用梯度洗脱：起始，5%（b）；0-1min (5%-5％b); 1-5min (5%-50％b); 5-19min (50%-98％b); 19-23min (98%-98％b);23.1-25min (5% b)。
3. 质谱条件 仪器：thermo scientic orbitrap id-x tribrid 三合一质谱仪，利用 acquirex 智能数据采集模式获得hr ms/ms，±esi 检测模式，离子 源参数如下：spray voltage ±3.5kv; sheath gas pressure: 40arb; aux gas pressure: 10arb; capillary temperature: 275℃; heater temperature: 350℃。质谱扫描参数：扫描范围 (scan range)（m/z） ：120-1500；full mass分辨率(orbitrap resolution)：120000，ms/ ms分辨率：30000；使用xcalibur 4.1和 compound discoverer 3.0 化学工作站进行数据处理
实验结果和讨论
1. acquire x智能化数据采集模式 中药代谢物由于其成分的高度复杂性，而且代谢物检测容易受到基 质的干扰，传统的dda模式很难采集到低含量代谢物的二级质谱图 进行定性分析，orbitrap id-x中的acquire x智能化数据采集模式可 以自动生成排除列表及包含列表，特别适合于复杂样品的深度分 析。acquirex采集数据过程中，以溶剂作为空白对照，用于自动生 成排除列表，排除背景离子；柴胡体外肠内菌孵育样品用于生成包 含列表。采集过程中将自动进行数据处理，实时更新采集方法。如 某一离子已经触发了ms/ms碎片，在下一针采集将自动加入到排 除列表中，避免数据的冗余，节省出更多时间用于ms/ms离子的 触发（如图1所示）。
2. 数据处理流程 数据处理采用compound discoverer (简称cd)的工作流程metabolism expected w fish and unknown w mdf pattern and compound class scoring进行代谢物的鉴定。实现自动峰提取、空白扣除、分 子式生成，代谢物查找及鉴定等步骤。软件中嵌入了常见的ⅰ相代 谢和ⅲ相代谢反应，可以用于已经代谢物的快速查找和鉴定工作。 此外上述工作流程还集合了mdf，fish trace，和pattern trace 多 种算法，可以用于未知代谢物的查找和鉴定（如图2）。在对代谢 物完成峰提取后，cd可以将代谢物的二级质谱图与母药的二级质 谱图进行镜像比对，帮助进行代谢位点确定。
3. fragment ion search (fish) 自动辅助进行代谢位点确认 选择柴胡中鉴定到的代表性物质柴胡皂苷a和绿原酸为母药，看这 些物质在孵育基质样品中的代谢情况。下图3a所示为柴胡皂苷a的 代谢物dehydration+dehydration+stearyl conjugation的二级质谱 图，绿色颜色标记的碎片为代谢物和母药相同的碎片，蓝色颜色标 记的碎片为代谢物的变化位点，由特征性碎片m/z 357.27844可知 此未知代谢物位点应在葡糖糖上。下图3b所示为绿原酸的代谢物 dehydration+dehydration+acetylation的二级质谱图，由特征性碎 片m/z 169.01262可知此未知代谢物位点应发生在奎尼酸上。
结论：本实验采用orbitrap id-x tribrid ms高分辨液质联用技术，结合 compound discoverer软件中的代谢物分析工作流程，对中药柴胡 体外肠内菌代谢物进行了快速准确的分析。compound discoverer 内置i 相+ii相代谢途径，针对已知和未知代谢物开采用质量亏损过 滤（mdf），碎片离子搜索策略（fish），特征同位素，共有碎片 检索等方式，寻找代谢物；同时软件提供多种统计学工具，通过不 同给药时间点或不同处理方式统计学差异，确证代谢物。选择柴胡 中鉴定到的代表性物质柴胡皂苷a和绿原酸为母药，在孵育基质样 品中柴胡皂苷a正离子模式共鉴定出14种可能的代谢物，负离子模 式鉴定出11种可能的代谢物；绿原酸共鉴定出5种可能的代谢物。
参考文献 [1] 邱峰, 浅谈中药成分体内代谢研究, 药学研究杂志，2010, 37, 321-327. [2] 中国药典[s]. 一部. 2015. [3] y. motoo and n. sawabu, “antitumor effects of saikosaponins, baicalin and baicalein on human hepatoma cell lines,” cancer letters, 1994, 86, 91–95. [4] m. s. idris-usman, “antinociceptive and antipyretic properties of the pharmaceutical herbal preparation, radix bupleuri in rats,” journal of medicinal plants research, 2010, 4, 659–663. [5] b. p. bermejo, m. j. a. martinez, a. m. s. sen et al., “in vivo and in vitro antiinammatory activity of saikosaponins,” life sciences, 1998, 63, 1147–1156. [6] g.q liu, y.t, g. li, l. xu, r. song, z.j zhang, metabolism of saikosaponin a in rats: diverse oxidations on the aglycone moiety in liver and intestine in addition to hydrolysis of glycosidic bonds, drug metab dispos, 2013, 41, 622–633. [7] pei yu, hongcong qiu, min wang, yuan tian, zunjian zhang, rui song. in vitro metabolism study of saikosaponin d and its derivatives in rat liver microsomes, xenobiotica, 2017, 47, 11-19. [8] 冯桂芳, 刘舒, 皮子凤, 宋凤瑞, 刘志强, 基于超高效液相色谱-质 谱联用技术的人参皂苷体外i相代谢研究, 质谱学报, 2017,
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为了更加深入的研究中药体内药效物质基础，需要利用高分辨质谱 对中药体内代谢物进行更深度的鉴定分析。然而由于中药体内的代 谢物通常含量很低，且同时受到基质背景的干扰，传统lc q-tof ms高分辨质谱的dda数据采集模式难以获得低含量代谢物的二级 质谱图用于结构鉴定。新一代赛默飞orbitrap id-x tribrid三合一质谱仪由 于具有acquire x智能化数据采集模式，自动迭代生成排除列表及 包含列表，可以获得极低含量组分的多级质谱用于代谢物的深度分 析。
柴胡bupleuri radix为伞形科植物柴胡（又称北柴胡）bulpeurum chinese dc. 和狭叶柴胡（又称南柴胡）bulpeurum scorzonerifolium willd的干燥根，其性味苦凉、微寒，具有解表和里、疏肝解 郁、升举阳气之功效[2]。柴胡化学成分复杂，其中皂苷类、挥发油 类、黄酮类为柴胡的主要活性成分，具有免疫调节、抗抑郁、保 肝、抗肿瘤、解热抗炎等药理作用[3-5]。近年来，液相色谱-质谱联 用技术（lc-ms）的成熟与发展已被应用于柴胡皂苷类组分的代谢研究[6,7]。然而，单个活性组分的代谢研究以及部分代谢物的鉴定结 果仍然无法全面综合的评价柴胡的质量和体内药效物质基础。
本实验采用离体实验的代谢研究方法，通过具有acquirex采集功能 的orbitrap id-x tribrid ms技术对柴胡代谢产物进行整体分析。首先 用富含肠内菌的粪便悬浮液与柴胡提取物在厌氧条件下温孵，利用 compound discoverer 3.0代谢物分析软件对采集的高分辨质谱数 据进行解析，终构建柴胡的肠内菌代谢指纹图，以期为中药的临 床合理应用奠定理论基础。
实验方法
1. 样品前处理 取柴胡粉末约20g，加入150ml 70%乙醇置于圆底烧瓶中，加热 回流提取60min，离心后取上清液，抽滤后滤液旋转蒸发浓缩至20 ml，冻干保存。肠内菌液的收集与制备参考文献[8]，培养时间分 别为0小时（对照组），1小时和24小时作为实验组样品。用等量 的磷酸钾缓冲溶液代替底物溶液，其它操作同实验组，此作为空白 组。
2. 色谱方法 超高效液相uhplc（dionex ultimate 3000，thermo fisher scientific）系统进行色谱分离，该系统由真空脱气机，自动进样器，柱 温箱，和二元泵组成。色谱柱为hypersil gold c18（2.1 mm × 100 mm，1.9μm，thermo fisher scientic）；流动相为0.1％甲酸水 （a）和乙腈100%（b）。流速为0.3ml / min，进样体积3ul， 柱温40℃；采用梯度洗脱：起始，5%（b）；0-1min (5%-5％b); 1-5min (5%-50％b); 5-19min (50%-98％b); 19-23min (98%-98％b);23.1-25min (5% b)。
3. 质谱条件 仪器：thermo scientic orbitrap id-x tribrid 三合一质谱仪，利用 acquirex 智能数据采集模式获得hr ms/ms，±esi 检测模式，离子 源参数如下：spray voltage ±3.5kv; sheath gas pressure: 40arb; aux gas pressure: 10arb; capillary temperature: 275℃; heater temperature: 350℃。质谱扫描参数：扫描范围 (scan range)（m/z） ：120-1500；full mass分辨率(orbitrap resolution)：120000，ms/ ms分辨率：30000；使用xcalibur 4.1和 compound discoverer 3.0 化学工作站进行数据处理
实验结果和讨论
1. acquire x智能化数据采集模式 中药代谢物由于其成分的高度复杂性，而且代谢物检测容易受到基 质的干扰，传统的dda模式很难采集到低含量代谢物的二级质谱图 进行定性分析，orbitrap id-x中的acquire x智能化数据采集模式可 以自动生成排除列表及包含列表，特别适合于复杂样品的深度分 析。acquirex采集数据过程中，以溶剂作为空白对照，用于自动生 成排除列表，排除背景离子；柴胡体外肠内菌孵育样品用于生成包 含列表。采集过程中将自动进行数据处理，实时更新采集方法。如 某一离子已经触发了ms/ms碎片，在下一针采集将自动加入到排 除列表中，避免数据的冗余，节省出更多时间用于ms/ms离子的 触发（如图1所示）。
2. 数据处理流程 数据处理采用compound discoverer (简称cd)的工作流程metabolism expected w fish and unknown w mdf pattern and compound class scoring进行代谢物的鉴定。实现自动峰提取、空白扣除、分 子式生成，代谢物查找及鉴定等步骤。软件中嵌入了常见的ⅰ相代 谢和ⅲ相代谢反应，可以用于已经代谢物的快速查找和鉴定工作。 此外上述工作流程还集合了mdf，fish trace，和pattern trace 多 种算法，可以用于未知代谢物的查找和鉴定（如图2）。在对代谢 物完成峰提取后，cd可以将代谢物的二级质谱图与母药的二级质 谱图进行镜像比对，帮助进行代谢位点确定。
3. fragment ion search (fish) 自动辅助进行代谢位点确认 选择柴胡中鉴定到的代表性物质柴胡皂苷a和绿原酸为母药，看这 些物质在孵育基质样品中的代谢情况。下图3a所示为柴胡皂苷a的 代谢物dehydration+dehydration+stearyl conjugation的二级质谱 图，绿色颜色标记的碎片为代谢物和母药相同的碎片，蓝色颜色标 记的碎片为代谢物的变化位点，由特征性碎片m/z 357.27844可知 此未知代谢物位点应在葡糖糖上。下图3b所示为绿原酸的代谢物 dehydration+dehydration+acetylation的二级质谱图，由特征性碎 片m/z 169.01262可知此未知代谢物位点应发生在奎尼酸上。
结论：本实验采用orbitrap id-x tribrid ms高分辨液质联用技术，结合 compound discoverer软件中的代谢物分析工作流程，对中药柴胡 体外肠内菌代谢物进行了快速准确的分析。compound discoverer 内置i 相+ii相代谢途径，针对已知和未知代谢物开采用质量亏损过 滤（mdf），碎片离子搜索策略（fish），特征同位素，共有碎片 检索等方式，寻找代谢物；同时软件提供多种统计学工具，通过不 同给药时间点或不同处理方式统计学差异，确证代谢物。选择柴胡 中鉴定到的代表性物质柴胡皂苷a和绿原酸为母药，在孵育基质样 品中柴胡皂苷a正离子模式共鉴定出14种可能的代谢物，负离子模 式鉴定出11种可能的代谢物；绿原酸共鉴定出5种可能的代谢物。
参考文献 [1] 邱峰, 浅谈中药成分体内代谢研究, 药学研究杂志，2010, 37, 321-327. [2] 中国药典[s]. 一部. 2015. [3] y. motoo and n. sawabu, “antitumor effects of saikosaponins, baicalin and baicalein on human hepatoma cell lines,” cancer letters, 1994, 86, 91–95. [4] m. s. idris-usman, “antinociceptive and antipyretic properties of the pharmaceutical herbal preparation, radix bupleuri in rats,” journal of medicinal plants research, 2010, 4, 659–663. [5] b. p. bermejo, m. j. a. martinez, a. m. s. sen et al., “in vivo and in vitro antiinammatory activity of saikosaponins,” life sciences, 1998, 63, 1147–1156. [6] g.q liu, y.t, g. li, l. xu, r. song, z.j zhang, metabolism of saikosaponin a in rats: diverse oxidations on the aglycone moiety in liver and intestine in addition to hydrolysis of glycosidic bonds, drug metab dispos, 2013, 41, 622–633. [7] pei yu, hongcong qiu, min wang, yuan tian, zunjian zhang, rui song. in vitro metabolism study of saikosaponin d and its derivatives in rat liver microsomes, xenobiotica, 2017, 47, 11-19. [8] 冯桂芳, 刘舒, 皮子凤, 宋凤瑞, 刘志强, 基于超高效液相色谱-质 谱联用技术的人参皂苷体外i相代谢研究, 质谱学报, 2017,
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