研域上海生物为您分享细胞技术分析

细胞技术作为一项生命科学领域的重要技术,想要使用好自然是不容易。相信不少小伙伴在使用几次之后,还是会有云里雾里的感觉。真正想掌握好一门技术,还是得从基础部分就做好。
1.如何搭配流式抗体荧光标记?
流式抗体荧光标记搭配主要由3个因素决定:流式细胞仪能检测多少个通道、需要同时检测多少个指标、厂家的抗体有多少种荧光标记。流式细胞仪的通道越多,那么同一份样本能同时检测的表面/胞内/核内蛋白就越多。以calibur为例说明:calibur的fl1通道选择了fitc就不能选择alexafluro488,或者选择了alexa fluro488就不能选fitc;calibur的fl3通道尽管能检测pe-texas red, pe-cy5, percp, percp-cy5.5, pe-cy7五个荧光素,但是我们搭配的时候只能选择其中1个。
2.如果检测的指标数目超过了流式细胞仪的通道,怎么办?
如果需要做5个指标,而流式细胞仪只能做4个通道,首先将指标归成2类,再将样本分成2份,分别检测。比如需要同时检测cd3、cd4、cd8、il-4和ifn-gamma,可以将样本分成两份,第1份加cd3、cd4、cd8 和il-4,而第2份加cd3、cd4、cd8和ifn-gamma。具体的归类方式可根据课题的设计来进行。
3.抗体染色的细胞不能立即检测该如何处理?
如果实验对细胞活性要求比较高,如凋亡实验,必须尽快检测;如果实验对细胞活性要求不高,可以使用含有4%多聚甲醛的pbs固定样本30分钟,固定后的细胞4℃过夜保存,次日检测。
4.同型对照的作用是什么?
抗体有时会和非抗原结合,可能会因为非特异的蛋白-蛋白相互作用结合细胞内成分,因为疏水作用结合脂肪,也可能会结合一些细胞表面表达的抗体受体。比如,igg亚型的抗体会结合细胞表面的fc受体,如cd16、cd32和cd64。理想条件下,各种类型的非特异性结合都可以通过蛋白(bsa、牛奶或动物血清)来阻断。fc受体的结合则可以通过与含免疫球蛋白的血清预孵育来阻断。一个抗体非特异性相互作用和受体结合的情况,可以用无关抗原的相同亚型抗体来比照。

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