破骨细胞培养高成功率的关键——高活性RANKL和M-CSF
01破骨细胞及其作用
破骨细胞是一种高度分化的多核巨细胞，主要来源于单核/巨噬细胞造血干细胞系，是骨组织吸收的主要功能细胞，参与贯穿生命始终的骨重建过程。建立破骨细胞体外培养方法有利于从细胞与分子水平进行骨吸收机制的研究，也有利于骨质疏松症、骨硬化症等代谢性骨病治疗药物的开发研究。因此，为了深入研究破骨细胞的形成机制并寻找其在疾病治疗中的应用，诱导分化破骨细胞成为了一个研究热点。破骨细胞由血液及骨髓中的单核/巨噬细胞系分化而来，其分化过程经历破骨细胞前体（osteoclast precursor cells，opcs，或称preosteoclasts）、融合的多核破骨细胞（non-functional polykaryons）、成熟破骨细胞（mature osteoclasts，也称极化的多核破骨细胞）等几个阶段。骨骼是一种动态组织，在结构应力和人体对钙的需求等影响下，骨骼不断被分解和重组。破骨细胞是骨骼持续破坏的介质，在骨发育、生长、修复、重建中具有重要的作用。
图1.破骨细胞分化过程图[1]
02破骨细胞标志物破骨细胞占据骨头表面的小凹陷，称为howship腔隙；这种腔隙被认为是由破骨细胞的酶对骨骼的侵蚀引起的。破骨细胞产生许多酶，其中主要是抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acidic phosphatase, trap），trap特异地分布于破骨细胞中，为破骨细胞所，通常作为鉴别破骨细胞的重要标志物。
03破骨细胞的获得在破骨细胞分化成熟的过程中，rank /rankl/opg系统起着分化调控枢纽的作用，是调节破骨细胞分化成熟的关键信号途径。核因子κb 受体活化因子配体（receptor activator for nuclear factor-κbligand，rankl）被认为是促进破骨细胞最为分化成熟及其功能活性最重要的因子，m-csf可诱导rank在破骨细胞前体的细胞膜上表达，进而使表达rank的破骨前体细胞和rankl结合并产生效应，诱导破骨细胞分化。因此在体外诱导破骨细胞分化过程中rankl和m-csf两种细胞因子缺一不可。现在破骨细胞主要采用的诱导法是骨髓单核细胞诱导法和raw264.7细胞系诱导法。
小鼠骨髓单核细胞诱导
实验方案：
取6-17周龄小鼠，使用co2吸入或颈椎脱臼致死。用70%酒精消毒小鼠毛皮。
小心地取出股骨和胫骨，并将其放入10厘米的培养皿中。
无菌条件下准备股骨和胫骨：
尽可能使用镊子和剪刀去除所有皮肤、肌腱和肌肉。
用手术刀或剪刀切掉所有骨头的两端。
使用5ml注射器和23-g针头在新鲜培养皿中用10ml破骨细胞培养基从所有骨头中冲洗出骨髓。丢弃已冲洗的骨骼。
使用1ml注射器和27-g针头，通过将细胞悬浮液吸入注射器和从注射器中抽出，尽可能分离细胞聚集体。然后，通过70µm细胞过滤器冲洗细胞悬液，并将其放入50 ml锥形离心管中。
用2ml培养基冲洗细胞过滤器的尼龙网。
获得的细胞悬液300×g，4°c下离心7min，弃上清。
用5ml红细胞裂解液重悬细胞。冰上裂解10min。
离心，弃上清。再用5ml含10%fbs的 α-mem培养基重悬，离心，弃上清。
用5ml含m-csf (25 ng/ml）和10%fbs的 α-mem培养基重悬细胞。接种于6孔细胞培养板中（每只小鼠一孔），置于37°c、5%co2细胞培养箱中过夜（14至18小时）。
第二天，吸取培养基，收集未粘附的细胞，注意勿刮擦平板底部。将培养基转移至50ml锥形离心管中。300×g，4℃，离心7min，弃上清。
用5ml含10%fbs的 α-mem培养基重悬细胞，并使用细胞计数装置计数活细胞。
以1×106cells/ml密度接种于培养板上，并加入m-csf（50ng/ml）和rankl（25–100 ng/ml）。
3天后更换培养基。第五天左右一般能观察到多核成熟破骨细胞。
trap染色鉴定破骨细胞。
注意：
使用的rankl和m-csf浓度可能因小鼠和实验室条件而异。
从rankl和m-csf添加后的第4天起，每天至少观察一次细胞，因为小鼠破骨细胞在分化后非常不稳定。破骨细胞形成初期，细胞呈纺锤形，成熟后，细胞变大，多核，呈圆形。与人类破骨细胞相反，小鼠破骨细胞在成熟后24小时内死亡。
由巨噬细胞系raw264.7诱导破骨细胞
实验方案：
用含10%fbs的α-mem培养基将raw264.7细胞制成细胞悬液，以3×104 cells/孔的密度接种于24孔板中。
细胞接种12h后，加入rankl（20-100ng/ml）。
每3天更换培养基，并同时补加rankl（20-100ng/ml）。
较为明显的多核破骨细胞将在分化培养4天后开始出现，并在第5天至第6天逐渐变得丰富。
进行trap染色，鉴定破骨细胞形成情况。
注意：
raw264.7细胞在含有10%fbs的rpmi-1640或deme培养基中可以增殖并保持其分化为破骨细胞的能力，而其在含有10%fbs的α-mem中培养可进行破骨细胞分化试验。
raw 264.7细胞表达m-csf及其受体c-fms。因此，仅加入rankl就足以诱导破骨细胞分化，无需额外加入m-csf。
（*以上方案供参考，根据实验情况具体优化）
04产品特点破骨细胞能否诱导成功影响因素众多，其中调节信号通路的关键细胞因子至关重要。翌圣生物提供高活性hiacti™细胞因子rankl和m-csf，高纯度、高质量，助力破骨细胞培养。
数据展示
高纯度（>95%）
高活性(cell based assay）
05相关产品信息
产品名称
货号
规格
mouse rankl
90630es08
5 μg
mouse m-csf
91114es10
10 μg
human rankl
90629es50
50 μg
human m-csf
91103es10
10 μg
参考文献
[1]william j. boyle*, w. scott simonet† & david l. lacey.osteoclast differentiation and activation.nature, 423, pages337–342 (2003).
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图1.破骨细胞分化过程图[1]
02破骨细胞标志物破骨细胞占据骨头表面的小凹陷，称为howship腔隙；这种腔隙被认为是由破骨细胞的酶对骨骼的侵蚀引起的。破骨细胞产生许多酶，其中主要是抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acidic phosphatase, trap），trap特异地分布于破骨细胞中，为破骨细胞所，通常作为鉴别破骨细胞的重要标志物。
03破骨细胞的获得在破骨细胞分化成熟的过程中，rank /rankl/opg系统起着分化调控枢纽的作用，是调节破骨细胞分化成熟的关键信号途径。核因子κb 受体活化因子配体（receptor activator for nuclear factor-κbligand，rankl）被认为是促进破骨细胞最为分化成熟及其功能活性最重要的因子，m-csf可诱导rank在破骨细胞前体的细胞膜上表达，进而使表达rank的破骨前体细胞和rankl结合并产生效应，诱导破骨细胞分化。因此在体外诱导破骨细胞分化过程中rankl和m-csf两种细胞因子缺一不可。现在破骨细胞主要采用的诱导法是骨髓单核细胞诱导法和raw264.7细胞系诱导法。
小鼠骨髓单核细胞诱导
实验方案：
取6-17周龄小鼠，使用co2吸入或颈椎脱臼致死。用70%酒精消毒小鼠毛皮。
小心地取出股骨和胫骨，并将其放入10厘米的培养皿中。
无菌条件下准备股骨和胫骨：
尽可能使用镊子和剪刀去除所有皮肤、肌腱和肌肉。
用手术刀或剪刀切掉所有骨头的两端。
使用5ml注射器和23-g针头在新鲜培养皿中用10ml破骨细胞培养基从所有骨头中冲洗出骨髓。丢弃已冲洗的骨骼。
使用1ml注射器和27-g针头，通过将细胞悬浮液吸入注射器和从注射器中抽出，尽可能分离细胞聚集体。然后，通过70µm细胞过滤器冲洗细胞悬液，并将其放入50 ml锥形离心管中。
用2ml培养基冲洗细胞过滤器的尼龙网。
获得的细胞悬液300×g，4°c下离心7min，弃上清。
用5ml红细胞裂解液重悬细胞。冰上裂解10min。
离心，弃上清。再用5ml含10%fbs的 α-mem培养基重悬，离心，弃上清。
用5ml含m-csf (25 ng/ml）和10%fbs的 α-mem培养基重悬细胞。接种于6孔细胞培养板中（每只小鼠一孔），置于37°c、5%co2细胞培养箱中过夜（14至18小时）。
第二天，吸取培养基，收集未粘附的细胞，注意勿刮擦平板底部。将培养基转移至50ml锥形离心管中。300×g，4℃，离心7min，弃上清。
用5ml含10%fbs的 α-mem培养基重悬细胞，并使用细胞计数装置计数活细胞。
以1×106cells/ml密度接种于培养板上，并加入m-csf（50ng/ml）和rankl（25–100 ng/ml）。
3天后更换培养基。第五天左右一般能观察到多核成熟破骨细胞。
trap染色鉴定破骨细胞。
注意：
使用的rankl和m-csf浓度可能因小鼠和实验室条件而异。
从rankl和m-csf添加后的第4天起，每天至少观察一次细胞，因为小鼠破骨细胞在分化后非常不稳定。破骨细胞形成初期，细胞呈纺锤形，成熟后，细胞变大，多核，呈圆形。与人类破骨细胞相反，小鼠破骨细胞在成熟后24小时内死亡。
由巨噬细胞系raw264.7诱导破骨细胞
实验方案：
用含10%fbs的α-mem培养基将raw264.7细胞制成细胞悬液，以3×104 cells/孔的密度接种于24孔板中。
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每3天更换培养基，并同时补加rankl（20-100ng/ml）。
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raw 264.7细胞表达m-csf及其受体c-fms。因此，仅加入rankl就足以诱导破骨细胞分化，无需额外加入m-csf。
（*以上方案供参考，根据实验情况具体优化）
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mouse rankl
90630es08
5 μg
mouse m-csf
91114es10
10 μg
human rankl
90629es50
50 μg
human m-csf
91103es10
10 μg
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