PCR 成功的四大要素及注意事项

一、模板1. 模板降解1）尽量选择新鲜提取的模板进行 pcr扩增，通过凝胶电泳检测模板的完整性，若降解严重需要重新制备模板；2）模板避免反复冻融。2. 模板中含有抑制 dna聚合酶活性的抑制剂1）采用离心柱法提取核酸，纯化模板，消除抑制剂的干扰；2）适当减少模板量，采用梯度稀释摸索最佳模板量；3）选用抗逆性强的 dna聚合酶。3.模板量太低1）适当增加模板量；2）模板为 cdna时，选用目的基因表达量高的组织提取高质量 rna并选用基因克隆专用的反转录试剂盒得到的 cdna作为模板；3）选用灵敏度高的 dna聚合酶。4. 高 gc, 复杂模板1）使用 pcr添加剂（比如 dmso，甜菜碱）或 gc enhancer，促进高 gc，复杂序列模板双链解离从而有利于引物退火和序列延伸；2）增加变性时间或温度，使 dna双链解离；3）选用适用于高 gc，复杂模板扩增的 dna聚合酶。5. 长片段1）确保模板的完整性；2）选择适用于长片段扩增的 taqdna 聚合酶或者高保真 dna聚合酶；3）在试剂盒说明书建议的延伸速度基础上适当延长延伸时间；4）采用抑制热交错 pcr（suppression thermo-interlaced pcr, sti pcr）策略。二、引物1.引物降解1）重新合成高质量引物，少量分装保存，防止多次冻融，避免长期置于冰箱冷藏部分。2.引物设计不合理1）建议使用引物设计软件（比如 primerpremier 6, oligo 7等）设计并选取评分较高的引物；2）确保引物和模板结合的特异性。三、dna聚合酶及其他反应组分1. dna聚合酶选择不合适1）根据实验目的选择合适的 dna聚合酶，比如分子克隆实验中涉及到序列的高保真扩增，需要选择一款针对不同类型序列具有普适性的高保真酶。2.dna聚合酶活力下降1）检查试剂是否过期，按照说明书要求合理保存试剂。3.反应缓冲液体系与目的基因不匹配1）不同目的 pcr反应要求反应缓冲液中的镁离子、钾离子、铵离子、化学添加剂等成分浓度是不一样的，建议使用试剂盒中优化好的缓冲液体系。四、反应条件1. 退火温度不合适，影响引物与模板特异结合1）使用引物设计软件建议的退火温度，退火温度一般比引物的 tm 值低 5 ℃；2）不同的试剂盐离子浓度不同，最佳的退火温度可能存在差异，建议以软件建议退火温度为中心设置温度梯度，来获得最佳退火温度；3）设置降落 pcr（step-down）反应程序。2. 其他反应条件不合适1）不同的 dna聚合酶试剂最佳反应条件是有差别的，选用试剂说明书建议的变性温度和时间，退火时间，延伸温度和速度，循环数。

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