小鼠脑膜组织提取物培养步骤
小鼠脑膜组织提取物培养步骤：
一．培养基及培养冻存条件准备：
1） 准备dmem-h培养基(gibco,添加nahco3 1.5g/l)，90%；胎牛血清，10%。也可根据实验需要选择悬浮培养基，使细胞悬浮生长。
2） 培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3） 冻存液：90%*培养基，10%dmso，现用现配。液氮储存。
二． 细胞处理：
1） 复苏细胞：将含有1ml细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4ml培养基混合均匀。在1000rpm条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2ml培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2） 细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：
1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的pbs润洗细胞1-2次。
2. 加2ml消化液（0.25%trypsin-0.53mm edta）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3. 按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000rpm条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2ml培养液后吹匀。
4. 将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量yi酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%dmso后进行冻存。
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2） 培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3） 冻存液：90%*培养基，10%dmso，现用现配。液氮储存。
二． 细胞处理：
1） 复苏细胞：将含有1ml细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4ml培养基混合均匀。在1000rpm条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2ml培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2） 细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：
1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的pbs润洗细胞1-2次。
2. 加2ml消化液（0.25%trypsin-0.53mm edta）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3. 按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000rpm条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2ml培养液后吹匀。
4. 将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量yi酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%dmso后进行冻存。
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