常见细胞培养问题解答
1. 如果收到一管冻存的细胞，能直接把它放到液氮中保存吗？
在很多情况下，干冰（-80°c）运输的细胞可以放回液氮，之后再进行快速解冻。然而，这样处理后可能降低细胞活力。对于一些敏感的细胞系，这可能使细胞复苏更加困难。这种现象被认为是由于温度变化导致的细胞内冰晶结构的改变。因此，建议细胞在收到后应尽快解冻和培养。减少在-80°c的储存时间，这种温度只用于运输。
2. 从液氮中取出细胞复苏时，应采取哪些安全措施？
在液氮中的细胞冻存管如果没有*密封，有液氮漏入，解冻时冻存管的气温急剧上升，可能会导致爆炸。因此，当从液氮中取出细胞时，建议佩戴护目镜和防护手套。复苏时，应将冻存管在37°c水浴中不断摇动，在1-2分钟内使冻存液*融化。之后用酒精棉球擦拭冻存管外壁，再拿入超净台内，将细胞转移到已加入10ml培养液的离心管内，1000 rpm下离心5～10分钟，弃去上清液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，置 5% co2孵箱静置培养。
3、为什么应将细胞储存在液氮罐中的气相而非液相？
细胞储存在液氮气相中更容易复苏。而在液氮的液相中，如果冻存管没有正确密封或有泄漏，细胞与液氮直接接触，会使细胞解冻后活力受到影响。
4、对于悬浮细胞，如何更换培养基？
培养悬浮细胞可以只是简单地添加新鲜培养基（如果空间允许）或者通过离心（100×g 5分钟）从旧培养基中分离细胞，随后将沉淀的细胞再悬浮于新鲜培养基中。然而，对于大多数悬浮细胞系，简单添加培养基是更好的方法。无论哪种方法，都需要细胞达到其zui大饱和密度之前更新培养基。细胞的饱和密度在3×105至2×106之间，具体依赖于细胞系和培养条件（静置或搅动、氧合水平等）。细胞必须稀释至较低的细胞浓度以允许足够的营养物质恢复，使细胞保持对数生长。假如只是简单地更换培养基而不降低细胞密度，细胞就会迅速耗竭培养基并死亡。如果细胞被稀释到其zui小密度之下，则会进入滞后期，生长非常缓慢，或者会死亡。每种悬浮细胞系的饱和密度和传代间隔都不一样，因此，每日细胞计数是监测悬浮细胞系的*方式。
5. 细胞培养推荐的co2水平是多少？
尽管细胞培养体系中的co2水平范围为0.03％~40%（通常大气中的co2约0.03％），但zui常见的在空气中不添加co2或者co2浓度为5％~10％。调节培养基中*的浓度以与气相中co2水平达到平衡非常重要。细胞会产生co2，需要少量的碳酸用于生长和存活。如果不添加co2并且细胞大量繁殖，则可以使用4mm（0.34g / l）的无水*。然而，这时培养瓶盖子应拧紧。如果培养体系需要5％或10％的co2，则在37℃下分别使用23.5mm（1.97g / l）或47mm（3.95g / l）*，初始ph为约7.6。在这些条件下，应使培养瓶松盖或使用培养皿来保持气体平衡。
6.为什么一些细胞需要丙酮酸钠？我应加多少丙酮酸钠到培养基中？
丙酮酸盐是糖酵解途径中的*个容易进出细胞的有机酸代谢物。 因此，培养基中添加丙酮酸钠能同时为合成代谢提供能量源和碳源，有助于维持某些特定的细胞，有助于细胞克隆或者在培养基中血清浓度降低时需要。丙酮酸钠还有助于降低荧光引发的细胞毒性。通常加入的丙酮酸钠终浓度为1mm。商品化的丙酮酸钠溶液通常为100mm储存液（100x）。
7. 培养瓶、培养板和培养皿中的细胞密度是多少？
请参考如下数据：
培养瓶
培养面积
培养液体积
细胞产量
t25
25cm2
5-10 ml
2.5 x 106
t75
75cm2
15-20 ml
7.5 x 106
t150
150cm2
30-50 ml
15.0 x 106
t175
175cm2
35-60 ml
17.5 x 106
t225
225cm2
45-75 ml
22.5 x 106
细胞产量根据细胞密度1 x 106cells/ cm2进行的估算。
细胞培养皿/板
培养面积
培养液体积
细胞产量
100 mm平皿
44 cm2
9 ml
44 x 105
6孔培养板
9.40 cm2
2.0 – 3 ml
9.4 x 105
12孔培养板
3.83 cm2
1.0 – 2.4 ml
3.83 x 105
24孔培养板
1.88 cm2
0.5 – 1.2 ml
1.88 x 105
48孔培养板
1 cm2/孔
0.3 – 0.6 ml
1.0 x 105
96孔培养板
0.32 cm2
0.1 – 0.2 ml
0.32 x 105
384孔培养板
0.06 cm2
25 – 50 ml
0.06 x 105
细胞产量根据细胞密度1 x 105cells/ cm2进行的估算。
多孔板中细胞的接种密度：
成像时*密度通常为7500-20000个细胞/孔（96孔板）和1000-4000个细胞/孔（384孔板）。细胞密度过高会导致自动对焦困难，特别是如果细胞长满，并且挤在一起，通常会导致一些细胞位于焦点之外。细胞密度过低，导致许多空白区域和焦点损失，特别是在使用较高放大倍数时。接种密度可以通过在培养板上接种不同稀释浓度的细胞，并使其在实验条件下生长（可以促进或阻止生长）来评估。
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在很多情况下，干冰（-80°c）运输的细胞可以放回液氮，之后再进行快速解冻。然而，这样处理后可能降低细胞活力。对于一些敏感的细胞系，这可能使细胞复苏更加困难。这种现象被认为是由于温度变化导致的细胞内冰晶结构的改变。因此，建议细胞在收到后应尽快解冻和培养。减少在-80°c的储存时间，这种温度只用于运输。
2. 从液氮中取出细胞复苏时，应采取哪些安全措施？
在液氮中的细胞冻存管如果没有*密封，有液氮漏入，解冻时冻存管的气温急剧上升，可能会导致爆炸。因此，当从液氮中取出细胞时，建议佩戴护目镜和防护手套。复苏时，应将冻存管在37°c水浴中不断摇动，在1-2分钟内使冻存液*融化。之后用酒精棉球擦拭冻存管外壁，再拿入超净台内，将细胞转移到已加入10ml培养液的离心管内，1000 rpm下离心5～10分钟，弃去上清液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，置 5% co2孵箱静置培养。
3、为什么应将细胞储存在液氮罐中的气相而非液相？
细胞储存在液氮气相中更容易复苏。而在液氮的液相中，如果冻存管没有正确密封或有泄漏，细胞与液氮直接接触，会使细胞解冻后活力受到影响。
4、对于悬浮细胞，如何更换培养基？
培养悬浮细胞可以只是简单地添加新鲜培养基（如果空间允许）或者通过离心（100×g 5分钟）从旧培养基中分离细胞，随后将沉淀的细胞再悬浮于新鲜培养基中。然而，对于大多数悬浮细胞系，简单添加培养基是更好的方法。无论哪种方法，都需要细胞达到其zui大饱和密度之前更新培养基。细胞的饱和密度在3×105至2×106之间，具体依赖于细胞系和培养条件（静置或搅动、氧合水平等）。细胞必须稀释至较低的细胞浓度以允许足够的营养物质恢复，使细胞保持对数生长。假如只是简单地更换培养基而不降低细胞密度，细胞就会迅速耗竭培养基并死亡。如果细胞被稀释到其zui小密度之下，则会进入滞后期，生长非常缓慢，或者会死亡。每种悬浮细胞系的饱和密度和传代间隔都不一样，因此，每日细胞计数是监测悬浮细胞系的*方式。
5. 细胞培养推荐的co2水平是多少？
尽管细胞培养体系中的co2水平范围为0.03％~40%（通常大气中的co2约0.03％），但zui常见的在空气中不添加co2或者co2浓度为5％~10％。调节培养基中*的浓度以与气相中co2水平达到平衡非常重要。细胞会产生co2，需要少量的碳酸用于生长和存活。如果不添加co2并且细胞大量繁殖，则可以使用4mm（0.34g / l）的无水*。然而，这时培养瓶盖子应拧紧。如果培养体系需要5％或10％的co2，则在37℃下分别使用23.5mm（1.97g / l）或47mm（3.95g / l）*，初始ph为约7.6。在这些条件下，应使培养瓶松盖或使用培养皿来保持气体平衡。
6.为什么一些细胞需要丙酮酸钠？我应加多少丙酮酸钠到培养基中？
丙酮酸盐是糖酵解途径中的*个容易进出细胞的有机酸代谢物。 因此，培养基中添加丙酮酸钠能同时为合成代谢提供能量源和碳源，有助于维持某些特定的细胞，有助于细胞克隆或者在培养基中血清浓度降低时需要。丙酮酸钠还有助于降低荧光引发的细胞毒性。通常加入的丙酮酸钠终浓度为1mm。商品化的丙酮酸钠溶液通常为100mm储存液（100x）。
7. 培养瓶、培养板和培养皿中的细胞密度是多少？
请参考如下数据：
培养瓶
培养面积
培养液体积
细胞产量
t25
25cm2
5-10 ml
2.5 x 106
t75
75cm2
15-20 ml
7.5 x 106
t150
150cm2
30-50 ml
15.0 x 106
t175
175cm2
35-60 ml
17.5 x 106
t225
225cm2
45-75 ml
22.5 x 106
细胞产量根据细胞密度1 x 106cells/ cm2进行的估算。
细胞培养皿/板
培养面积
培养液体积
细胞产量
100 mm平皿
44 cm2
9 ml
44 x 105
6孔培养板
9.40 cm2
2.0 – 3 ml
9.4 x 105
12孔培养板
3.83 cm2
1.0 – 2.4 ml
3.83 x 105
24孔培养板
1.88 cm2
0.5 – 1.2 ml
1.88 x 105
48孔培养板
1 cm2/孔
0.3 – 0.6 ml
1.0 x 105
96孔培养板
0.32 cm2
0.1 – 0.2 ml
0.32 x 105
384孔培养板
0.06 cm2
25 – 50 ml
0.06 x 105
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成像时*密度通常为7500-20000个细胞/孔（96孔板）和1000-4000个细胞/孔（384孔板）。细胞密度过高会导致自动对焦困难，特别是如果细胞长满，并且挤在一起，通常会导致一些细胞位于焦点之外。细胞密度过低，导致许多空白区域和焦点损失，特别是在使用较高放大倍数时。接种密度可以通过在培养板上接种不同稀释浓度的细胞，并使其在实验条件下生长（可以促进或阻止生长）来评估。
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