实时荧光定量PCR技术原理与操作
实时荧光定量pcr（real time pcr）是在pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个pcr进程，并对起始模板进行定量分析的方法。其涉及领域包括：临床疾病诊断、动物检验检疫、食品安全和科学研究等。在xin型guan状病毒、肝炎、艾zi病、流感、登革热、感染性腹泻等的检测、诊断和治疗上发挥着重要作用。
实时荧光定量pcr法可分别为sybr green l荧光染料法和taqman探针法。日常进行核酸检测就是运用taqman探针法，新guan病毒核酸检测也是利用此项技术。该法高度特异，其核心是利用taq酶的3’→5’外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。
在taqman探针法的定量pcr反应体系中，包括一对pcr引物和一条探针。探针的5’端标记有报告基团（reporter，r），如fam、vic等，3’端标记有荧光淬灭基团（quencher，q），如tamra等。当探针完整时，报告基团所发射的荧光被淬灭基团吸收，仪器不能检测信号。随着pcr反应的进行，taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3’→5’外切核酸酶活性被探针切断，报告基团远离淬灭基团，能量不能被吸收，就产生荧光信号。因此每经过一个循环，荧光信号就和目的片段一样有一个同步指数增长过程。
这里涉及基线和ct值的概念。基线是用来确定背景的荧光信号强度的参比对照，相当于pcr指数扩增期以前的荧光强度水平。ct值是pcr扩增过程中，荧光信号开始由本底指数增长阶段的拐点所对应的循环次数，其由扩增反应体系中模板的初始浓度决定。
与传统pcr相比，实时荧光定量pcr有着以下优点：
1．检测结果既可以定性，也可以定量；
2．检测灵敏度高；
3．无需进行凝胶电泳实验，节省实验时间，提高了效率。
图1 taqman探针法工作原理
图2 实时荧光定量pcr的几个主要参数
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