液相色谱仪由高压*、进样系统、温度控制系统、色谱柱、检测器、信号记录系统等部分组成,主要利用混合物在液-固或不互溶的两种液体之间分配比的差异,对混合物进行先分离,而后分析鉴定的仪器。因其具有、快速、灵敏等特点,被广泛应用于生物化学、生物医学、环境化学、石油化工等行业。液相色谱仪检测方法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法(正相与反相)、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。
一、液-固吸附色谱法
液-固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相,吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质(常用的吸附剂为硅胶或氧化铝),在它们的表面存在吸附中心。液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。
分离原理:当流动相通过固定相时,吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时,当试样分子被流动相带入柱内,只要它们在固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流动相溶剂分子,于是,在固定相表面发生竞争吸附。
二、液-液分配色谱法
按照固定相与流动相的极性差别,可把液-液色谱法分为正相与反相色谱法两类。
(1) 正相液-液色谱法 流动相极性小于固定相极性的液-液色谱法称为正相液-液色谱法,简称正相色谱法或称正相洗脱、正相冲洗。在作正相洗脱时,主要靠组分的极性差别产生的溶解度差别而分离。样品中极性小的组分先流出色谱柱,极性大的组分后出柱。这是因为极性小的组分在固定相中的溶解度小,容量因子小的缘故。
(2) 反相液-液色谱法 流动相极性大于固定相极性的液-液色谱法称为反相液-液色谱法,简称反相色谱法或称为反相洗脱/冲洗。在作反相洗脱时,样品中极性大的组分先流出色谱柱,极性小的组分后出柱,与正相洗脱正好相反。
三、离子交换色谱法
离子交换色谱法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。凡在溶液中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法进行分离。
离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱的固定相一般为离子交换树脂,树脂分子结构中存在许多可以电离的活性中心,待分离组分中的离子会与这些活性中心发生离子交换,形成离子交换平衡,从而在流动相与固定相之间形成分配,固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心,并随着流动相的运动而运动,zui终实现分离。
四、离子对色谱法
离子对色谱法是将一种(或多种)与溶质分子电荷相反的离子(称为对离子或反离子)加到流动相或固定相中,使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物,从而控制溶质离子的保留行为。根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后,在非极性固定相中溶解度增大,从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。
五、分子排阻色谱法
分子排阻色谱法又称空间排阻色谱法(sec)是利用多孔凝胶固定相的*性产生的一种,主要根据凝胶孔隙的孔径大小与高分子样品分子的线团尺寸间的相对关系而对溶质进行分离的分析的方法。
品分子与固定相之间不存在相互作用,色谱固定相是多孔性凝胶,仅允许直径小于孔径的组分进入,这些孔对于溶剂分子来说是相当大的,以致溶剂分子可以自由的扩散出入。样品中的大分子不能进入凝胶孔洞而*被排阻,只能沿多孔凝胶粒子之间的空隙通过色谱柱,首先从柱中被流动相洗脱出来;中等大小的分子能进入凝胶中一些适当的孔洞中,但不能进入更小的微孔,在柱中受到滞留,较慢地从色谱柱洗脱出来;小分子可进入凝胶中绝大部分孔洞,在柱中受到更强的滞留,会更慢的被洗脱出;溶解样品的溶剂分子,其分子量zui小,可进入凝胶的所有孔洞,zui后从柱中流出,从而实现具有不同分子大小样品的*分离。
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