直链淀粉和支链淀粉的测定（双波长法）
一、目的
淀粉一般都是直链淀粉和支链淀粉的混合物。直链淀粉和支链淀粉含量和比例因植物种类而不同，决定着谷物种子的出饭率和食味品质，并影响着谷物的贮藏加工。通过本实验学习掌握双波长测定谷物中直链淀粉和支链淀粉的含量。
二、原理
根据双波长比色原理，如果溶液中某溶质在两个波长下均有吸收，则两个波长的吸收差值与溶质浓度成正比。
直链淀粉与碘作用产生纯蓝色，支链淀粉与碘作用生成紫红色。如果用两种淀粉的标准溶液分别与碘反应，然后在同一个坐标系里进行扫描（ 400 - 960 mm） 或做吸收曲线，可以得到图所示结果。
图 作图法选择淀粉的测定波长
图中 1 为直链淀粉的吸收曲线， 2 为支链淀粉的吸收曲线。对含有直链淀粉和支链淀粉的未知样品，与碘显色后，只要在选定的波长λ1 ，λ 2 ， λ 3 ，λ 4 ，处作 4 次比色，利用直链淀粉和支链淀粉标准曲线即可分别求出样品中两类淀粉的含量。
三、仪器、试剂和材料
1. 仪器
（1） 电子分析天平
（2 ）索氏脂肪抽提器 1 套
（3 ）美析仪器分光光度计 1 台
（4 ） ph 计
（5 ）容量瓶 100ml x 2 ， 50ml x 16
（6 ）吸管 0.5ml x 1， 2ml x 1， 5ml x 1
2. 试剂
（ 1） ether或石油醚（沸程 30-60 ℃）
（2 ）无水乙醇
（ 3 ） 0.5 ml / l koh 溶液
（ 4 ） 0.1 mol / l hcl 溶液
（5） 碘试剂：称取* 2.0g， 溶于少量蒸馏水，再加碘 0.2g， 待溶解后用蒸馏水稀释定容至 l00ml.
（6） 直链淀粉标准液：称取直链淀粉纯品 0.1000g， 放在 100ml 容量瓶中，加入 0.5mol/ l koh 10ml， 在热水中待溶解后，取出加蒸馏水定容至 100ml， 即为 1mg/ml 直链淀粉标准溶液。
（7） 支链淀粉标准液：用 0.1000g 支链淀粉按 （6） 法制备成 1mg/ml 支链淀粉标准溶液。
3. 材料
供试谷物粉。
四、操作步骤
1 .选择直链、支链淀粉测定波长、参比波长。
直链淀粉：取 1mg/ml 直链淀粉标准液 1ml， 放入 50ml 容量瓶中，加蒸馏水 30ml， 以 0.1 mol/ l hcl 溶液调至 ph 3.5 左右，加入碘试剂 0.5ml， 并以蒸馏水定容。静置 20min ，以蒸馏水为空白，用双光束分光光度计进行可见光全波段扫描或用普通比色法绘出直链淀粉吸收曲线。
支链淀粉：取 1 mg/ml 支链淀粉标准液 1ml， 放入 50ml 容量瓶中，以下操作同直链淀粉。在同一坐标内获得支链淀粉可见光波段吸收曲线。
根据原理部分介绍的方法，确定直链淀粉和支链淀粉的测定波长、参比波长λ 2 、λ 1 、λ 4 和λ 3 。
2 .制作双波长直链淀粉标准曲线：吸取 1mg/ml 直链淀粉标准溶液 0.3 、 0.5 、 0.7 、 0.9 、 1.1 、 1.3 ml 分别放入 6 只不同的 50ml 容量瓶中，加入蒸馏水 30ml ，以 0.1 mol/ l hcl 溶液调至 ph 3.5 左右，加入碘试剂 0.5 ml， 并用蒸馏水定容。静置 20min， 以蒸馏水为空白，用 1cm 比色杯在λ 1、λ 2 两波长下分别测定 a λ 1，a λ 2 即得△ a 直 = a λ1 - a λ 2 以△ a 直为纵坐标，直链淀粉含量（mg ）为横坐标，制备双波长直链淀粉标准曲线。
3 .制作双波长支链淀粉标准曲线：吸取 1mg/ml 支链淀粉标准溶液 2.0， 2.5 、 3.0 、 3.5 、 4.0 、 4.5 分别放入 6 只不同的 50ml 容量瓶中。以下操作同直链淀粉。以蒸馏水为空白，用 1cm 比色杯在λ 3 ，λ 4 两波长下分别测定其 a λ 3，a λ 4 即得△ a 支 = a λ 4- a λ 3。以△ a 支为纵坐标，支链淀粉含量（mg ）为横坐标，制备双波长支链淀粉标准曲线。
4. 样品中一直链淀粉、支链淀粉及总淀粉的测定：样品粉碎过 60 目筛，用ether脱脂，称取脱脂样品 0.1g 左右（至 1mg ），置于 50ml容量瓶中。加 0.5 mol/ l koh 溶液 10ml， 在沸水浴中加热10min， 取出，以蒸馏水定容至 50ml 若有泡沫采用乙醇消除），静置。吸取样品液 2.5ml 两份（即样品测定液和空白液），均加蒸馏水 30ml， 以 0.1mol/lhci 溶液调至 ph 3.5 左右，样品中加入碘试剂 0.5ml， 空白液不加碘试剂，然后均定容至 50ml 。静置 20min ，以样品空白液为对照，用 1cm 比色杯，分别测定λ 2， λ 1， λ 4， λ 3 的吸收值 a λ 2， a λ 1， a λ 4， a λ 3。得到△ a 直 = a λ 2 - a λ 1 ，△ a 支=a λ 4-a λ 3 。 分别查两类淀粉的双波长标准曲线，即可计算出脱脂样品中直链淀粉和支链淀粉含量。二者之和等于总淀粉含量。
五、结果处理
式中， x1 一查双波长直链淀粉标准曲线得样品液中直链淀粉含量（mg）
x2 一查双波长支链淀粉标准曲线得样品液中支链淀粉含量（mg）
m 一样品质量 （g）
总淀粉（%）= 直链淀粉（%）+支链淀粉（%）
六、注意事项
因蜡质和非蜡质支链淀粉碘复合物颜色差异较大，在制备双波长支链淀粉曲线时，应根据测定的谷物类型选择不同支链淀粉纯品（蜡质或非蜡质型）。
七、思考题
1. 双波长法测定谷物中直链、支链淀粉的原理是什么？
2. 除了双波长法外，比色法（ 620nm ）和安培滴定法也能分别测定直链和支链淀粉。了解其原理，比较不同方法的优缺点。
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二、原理
根据双波长比色原理，如果溶液中某溶质在两个波长下均有吸收，则两个波长的吸收差值与溶质浓度成正比。
直链淀粉与碘作用产生纯蓝色，支链淀粉与碘作用生成紫红色。如果用两种淀粉的标准溶液分别与碘反应，然后在同一个坐标系里进行扫描（ 400 - 960 mm） 或做吸收曲线，可以得到图所示结果。
图 作图法选择淀粉的测定波长
图中 1 为直链淀粉的吸收曲线， 2 为支链淀粉的吸收曲线。对含有直链淀粉和支链淀粉的未知样品，与碘显色后，只要在选定的波长λ1 ，λ 2 ， λ 3 ，λ 4 ，处作 4 次比色，利用直链淀粉和支链淀粉标准曲线即可分别求出样品中两类淀粉的含量。
三、仪器、试剂和材料
1. 仪器
（1） 电子分析天平
（2 ）索氏脂肪抽提器 1 套
（3 ）美析仪器分光光度计 1 台
（4 ） ph 计
（5 ）容量瓶 100ml x 2 ， 50ml x 16
（6 ）吸管 0.5ml x 1， 2ml x 1， 5ml x 1
2. 试剂
（ 1） ether或石油醚（沸程 30-60 ℃）
（2 ）无水乙醇
（ 3 ） 0.5 ml / l koh 溶液
（ 4 ） 0.1 mol / l hcl 溶液
（5） 碘试剂：称取* 2.0g， 溶于少量蒸馏水，再加碘 0.2g， 待溶解后用蒸馏水稀释定容至 l00ml.
（6） 直链淀粉标准液：称取直链淀粉纯品 0.1000g， 放在 100ml 容量瓶中，加入 0.5mol/ l koh 10ml， 在热水中待溶解后，取出加蒸馏水定容至 100ml， 即为 1mg/ml 直链淀粉标准溶液。
（7） 支链淀粉标准液：用 0.1000g 支链淀粉按 （6） 法制备成 1mg/ml 支链淀粉标准溶液。
3. 材料
供试谷物粉。
四、操作步骤
1 .选择直链、支链淀粉测定波长、参比波长。
直链淀粉：取 1mg/ml 直链淀粉标准液 1ml， 放入 50ml 容量瓶中，加蒸馏水 30ml， 以 0.1 mol/ l hcl 溶液调至 ph 3.5 左右，加入碘试剂 0.5ml， 并以蒸馏水定容。静置 20min ，以蒸馏水为空白，用双光束分光光度计进行可见光全波段扫描或用普通比色法绘出直链淀粉吸收曲线。
支链淀粉：取 1 mg/ml 支链淀粉标准液 1ml， 放入 50ml 容量瓶中，以下操作同直链淀粉。在同一坐标内获得支链淀粉可见光波段吸收曲线。
根据原理部分介绍的方法，确定直链淀粉和支链淀粉的测定波长、参比波长λ 2 、λ 1 、λ 4 和λ 3 。
2 .制作双波长直链淀粉标准曲线：吸取 1mg/ml 直链淀粉标准溶液 0.3 、 0.5 、 0.7 、 0.9 、 1.1 、 1.3 ml 分别放入 6 只不同的 50ml 容量瓶中，加入蒸馏水 30ml ，以 0.1 mol/ l hcl 溶液调至 ph 3.5 左右，加入碘试剂 0.5 ml， 并用蒸馏水定容。静置 20min， 以蒸馏水为空白，用 1cm 比色杯在λ 1、λ 2 两波长下分别测定 a λ 1，a λ 2 即得△ a 直 = a λ1 - a λ 2 以△ a 直为纵坐标，直链淀粉含量（mg ）为横坐标，制备双波长直链淀粉标准曲线。
3 .制作双波长支链淀粉标准曲线：吸取 1mg/ml 支链淀粉标准溶液 2.0， 2.5 、 3.0 、 3.5 、 4.0 、 4.5 分别放入 6 只不同的 50ml 容量瓶中。以下操作同直链淀粉。以蒸馏水为空白，用 1cm 比色杯在λ 3 ，λ 4 两波长下分别测定其 a λ 3，a λ 4 即得△ a 支 = a λ 4- a λ 3。以△ a 支为纵坐标，支链淀粉含量（mg ）为横坐标，制备双波长支链淀粉标准曲线。
4. 样品中一直链淀粉、支链淀粉及总淀粉的测定：样品粉碎过 60 目筛，用ether脱脂，称取脱脂样品 0.1g 左右（至 1mg ），置于 50ml容量瓶中。加 0.5 mol/ l koh 溶液 10ml， 在沸水浴中加热10min， 取出，以蒸馏水定容至 50ml 若有泡沫采用乙醇消除），静置。吸取样品液 2.5ml 两份（即样品测定液和空白液），均加蒸馏水 30ml， 以 0.1mol/lhci 溶液调至 ph 3.5 左右，样品中加入碘试剂 0.5ml， 空白液不加碘试剂，然后均定容至 50ml 。静置 20min ，以样品空白液为对照，用 1cm 比色杯，分别测定λ 2， λ 1， λ 4， λ 3 的吸收值 a λ 2， a λ 1， a λ 4， a λ 3。得到△ a 直 = a λ 2 - a λ 1 ，△ a 支=a λ 4-a λ 3 。 分别查两类淀粉的双波长标准曲线，即可计算出脱脂样品中直链淀粉和支链淀粉含量。二者之和等于总淀粉含量。
五、结果处理
式中， x1 一查双波长直链淀粉标准曲线得样品液中直链淀粉含量（mg）
x2 一查双波长支链淀粉标准曲线得样品液中支链淀粉含量（mg）
m 一样品质量 （g）
总淀粉（%）= 直链淀粉（%）+支链淀粉（%）
六、注意事项
因蜡质和非蜡质支链淀粉碘复合物颜色差异较大，在制备双波长支链淀粉曲线时，应根据测定的谷物类型选择不同支链淀粉纯品（蜡质或非蜡质型）。
七、思考题
1. 双波长法测定谷物中直链、支链淀粉的原理是什么？
2. 除了双波长法外，比色法（ 620nm ）和安培滴定法也能分别测定直链和支链淀粉。了解其原理，比较不同方法的优缺点。
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