重组质粒的转化、筛选和鉴定操作
实验原理：
重组子的建立：采用双酶切 质粒 载体pbr322和puc18,酶切后产生了互补的粘性末端,在t4 dna 连接酶的作用下,两个质粒片段连接.
感受态细胞(competent cells)：受体细胞经过一些特殊方法(如：cacl,rucl等化学试剂法)的处理后, 细胞膜 的通透性发生变化,成为能容许多有外源dna的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) .
转化(transformation)：是将异源dna分子引入一 细胞株 系,使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段,是基因工程等研究领域的基本实验技术.
电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞,通过高压脉冲的作用将载体dna分子导入受体细胞.
克隆的筛选：主要用不同 抗生素 基因筛选.常用的 抗生素 有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；
重组质粒克隆的鉴定：鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有α-互补、小规模制备质粒dna进行酶切分析、插入失活、pcr以及杂交筛选的方法.
方法是小规模制备质粒dna进行酶切分析,对于带有lacz基因的载体还可以结合α-互补现象来筛选.
操作方法：
1、构建重组质粒
质粒puc18和pbr322分别用pst i和ecor i双酶切,将酶切产物按照1：1的比例混合,使用t4 dna连接酶连接,构建成重组质粒.
2、制备感受态大肠杆菌细胞
收集大肠杆菌细胞,采用cacl2处理,制备成 感受态细胞 .
3、重组子的转化
将构建的重组质粒加入到制备的感受态细胞悬浮液中,电击法将重组质粒转化到宿主细胞中.
4、重组子的筛选鉴定
采用蓝白筛选重组子.酚/氯/仿快速抽提质粒,酶切后 电泳 鉴定.步骤与注意事项：
1、连接反应温度选择要适中,过高粘末端之间形成氢键不稳定,过低会影响 连接酶 的活性.
2、连接反应两种质粒的比例为1：1,否则容易自连.
3、制备感受态细胞时要采用对数生长期初期的细胞,低温处理时间要足够.
4、电击法时电击电压、电流、时间选择要合适.
5、转化及蓝白筛选要作阴、阳性对照,防止出现假阳性、假阴性.
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克隆的筛选：主要用不同 抗生素 基因筛选.常用的 抗生素 有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；
重组质粒克隆的鉴定：鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有α-互补、小规模制备质粒dna进行酶切分析、插入失活、pcr以及杂交筛选的方法.
方法是小规模制备质粒dna进行酶切分析,对于带有lacz基因的载体还可以结合α-互补现象来筛选.
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1、构建重组质粒
质粒puc18和pbr322分别用pst i和ecor i双酶切,将酶切产物按照1：1的比例混合,使用t4 dna连接酶连接,构建成重组质粒.
2、制备感受态大肠杆菌细胞
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3、重组子的转化
将构建的重组质粒加入到制备的感受态细胞悬浮液中,电击法将重组质粒转化到宿主细胞中.
4、重组子的筛选鉴定
采用蓝白筛选重组子.酚/氯/仿快速抽提质粒,酶切后 电泳 鉴定.步骤与注意事项：
1、连接反应温度选择要适中,过高粘末端之间形成氢键不稳定,过低会影响 连接酶 的活性.
2、连接反应两种质粒的比例为1：1,否则容易自连.
3、制备感受态细胞时要采用对数生长期初期的细胞,低温处理时间要足够.
4、电击法时电击电压、电流、时间选择要合适.
5、转化及蓝白筛选要作阴、阳性对照,防止出现假阳性、假阴性.
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