体外诊断业的宠儿——游离DNA
随着2015年精准医疗计划的提出，液体活检技术备受关注。液体活检常见的三种有效素材主要有：游离dna(circulating cell-free dna, cfdna)、循环肿瘤dna（circulating tumor dna, ctdna）、外泌体。
图1 液体活检方案。人体血液中含有细胞、胞外膜囊泡(emvs)、游离dna (cfdna)、游离rna (cfrna)和蛋白质，可作为各种疾病的生物标志物
一、什么是游离dna?
游离dna又称循环dna、无细胞dna，是指存在于血浆、血清或尿液等体液中的细胞外dna。循环肿瘤dna是指坏死或凋亡的肿瘤细胞释放到外周血中的肿瘤dna片段，是肿瘤患者cfdna的一种。最早在1948年，mandel次在人类血液中检测到存在cfdna,但当时并没有引起科学界的关注。直到1977年,leon等报道了肿瘤患者外周血中存在较高水平的cfdna，随后众多学者开始了肿瘤患者外周血中cfdna研究。1997年,香港的卢煜明教授运用pcr技术在孕妇的血浆中扩增了y染色体特异性片段,证明怀有男胎的孕妇血浆中存在胎儿cfdna,从而为无创产前筛查奠定了基础。
关于cfdna的产生来源，目前普遍认为细胞主动释放、细胞发生凋亡、细胞坏死释放的dna片段是cfdna的主要来源。一般来说，癌症患者的正常循环cfdna水平比健康人高得多。因为随着肿瘤体积的增大，细胞的更新也随之增加，凋亡和坏死细胞的数量也随之增加。在正常的生理情况下，凋亡和坏死的残留物可通过浸润的吞噬细胞清除。但这不能有效地发生在肿瘤肿块内，导致细胞碎片的积累不可避免地释放到循环中使cfdna浓度显著升高。
图2 游离dna的主要来源
cfdna大部分为双链dna分子，其片段分布与核小体的结构有关，每个核小体单位包括一个组蛋白八聚体、dna分子及一分子h1；组蛋白八聚体构成核小体的盘状核心结构，146bp的dna分子超螺旋盘绕组蛋白八聚体1.75圈，组蛋白h1在核心颗粒外结合额外20bp dna，锁住核小体dna的进出端，起到稳定核小体的作用。因此cfdna长度主要集中在80-300bp,峰值位于166bp左右，且存在10.4bp的波动。cfdna在健康个体中通常浓度很低，血浆cfdna被认为主要来自造血系正常细胞的凋亡，其他组织的贡献很小。并且cfdna的半衰期很短，仅1-2小时，不稳定易降解。
相比于组织而言，检测cfdna具有三大优势1.可及性：cfdna容易获取，且可以反复取样；2.全面性：可全面反映肿瘤组织的异质性；3.实时性：可实时动态监测疾病的状态（如耐药方面），因此cfdna检测逐渐成为体外诊断应用方面的宠儿。
图3 cfdna的结构
图4 常规测序文库制备测定cfdna的片段长度
二、游离dna应用实例
图5 cfdna的应用
1.无创产前筛查（nipt）
基于1997年卢煜明教授及其团队发现孕妇的血浆内存有高浓度的胎儿dna，他们研发推出了唐氏综合征的无创检验方法—nipt（noninvasive prenatal testing），迅速被超过90个国家所采用。nipt即无创性胎儿染色体非整倍体检测，也称无创产前dna检测,在临床上主要用于唐氏综合征的筛查。通过采集孕妈妈外周血，从中提取游离dna（包含妈妈和宝宝dna），来分析宝宝的染色体情况。但以目前的医疗水平还不能治愈唐氏综合征，所以加强孕期产检，减少唐氏综合征患儿的出生十分重要。
图6 nipt检验流程
2.肿瘤相关分析
无需有创肿瘤活检，而是直接从常规抽血中分析来自肿瘤的dna，cfdna分析在癌症发展、诊断和治疗的整个自然过程中具有多种潜在应用。web of science引文报告显示：2017年与2018年间与cfdna研究有关的文章，51%聚焦于肿瘤方面，由此可见cfdna在肿瘤方向的应用火热。2016年6月1日，fda批准首ge适用于血液cfdna检测的、用于检测非小细胞肺癌(nsclc)患者表皮生长因子受体(egfr)基因突变的基因检测试剂盒，这是作为cfdna首cii应用于肿瘤伴随诊断、药物疗效监测的批准。同时nitzan等于nature reviews cancer杂志上发表名为“liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour dna”的文章表明ctdna可用于耐药突变及新发突变分析。
图7 ctdna可用于耐药突变及新发突变分析应用
2020年发表于nature杂志上的一篇文章，研究者对早期的肺癌患者治疗前血浆中ctdna的含量进行检测研究，发现在一定时间内（监测100个月）肺癌患者治疗前ctdna高的病人复发率以及远处转移率均高于ctdna含量低的病人，因此ctdna对于肿瘤的监测及预后方面具有一定积极意义。
图8 cfdna在肿瘤动态监测、预后方面的应用
jay shendure等于cell杂志上发表的文章利用癌症患者的ctdna样本进行测序，发现不同的癌症类型可以ctdna上产生不同的核小体的指纹。因此对于某些癌症患者而言，研究者可以利用ctdna鉴别肿瘤的组织学来源。
图9 ctdna可以用于分析肿瘤组织来源（在癌症溯源方面应用）
由复旦大学金力院士牵头的癌症早筛研究结果于2020年发表于nature communication杂志，该研究采用panseer癌症早筛技术，通过检测cfdna甲基化状态实现多癌种筛查，可提前4年发现癌症患者血液中的甲基化信号，实现癌症早筛的功能。
图10 cfdna在癌症早筛中的应用
3.微生物感染诊断
与传统微生物检测相比，微生物游离dna(mcfdna)检测阳性率更高，mcfdna目前已在临床感染的诊治中发挥了重要作用，如脓毒症、社区获得性肺炎、结核病、侵袭性真菌病、尿路感染、器guan移植后感染等。blauwkamp等于nature microbiology上发表的血浆mcfdna高通量测序研究中表明：临床纳入348例疑似脓毒症患者，与首ci阳性的血培养相比，其阳性符合率为93.7%。在出现症状前出现抗菌药物的患者中，ngs检出可靠或者确定的病原比例为47.9%，血培养灵敏度为19.6%，由此可见mcf检测微生物感染的优势。
图11 微生物游离dna在感染诊断中的应用
三、本期产品推荐
货号 产品名称 规格
abs60277 中大量血浆dna提取试剂盒 30t/60t
abs60273 血清血浆游离dna提取试剂盒（小提） 50t/100t
abs60274 血清血浆游离dna提取试剂盒（中提） 10t/20t
abs60147 游离dna提取试剂盒 2ml×50t
abs60148 游离dna提取试剂盒 5ml×50t/5ml×10t
abs60323 核酸富集提取装置 1ea
参考文献
【1】szilágyi m, pös o, márton é, et al. circulating cell-free nucleic acids: main characteristics and clinical application.int j mol sci. 2020;21(18):6827. published 2020 sep 17. doi:10.3390/ijms21186827
【2】lo ym, corbetta n, chamberlain pf, et al. presence of fetal dna in maternal plasma and serum.lancet. 1997;350(9076):485-487. doi:10.1016/s0140-6736(97)02174-0
【3】snyder mw, kircher m, hill aj, daza rm, shendure j. cell-free dna comprises an in vivo nucleosome footprint that informs its tissues-of-origin.cell. 2016;164(1-2):57-68. doi:10.1016/j.cell.2015.11.050
【4】wan jcm, massie c, garcia-corbacho j, et al. liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour dna.nat rev cancer. 2017;17(4):223-238. doi:10.1038/nrc.2017.7
【5】chabon jj, hamilton eg, kurtz dm, et al. integrating genomic features for non-invasive early lung cancer detection.nature. 2020;580(7802):245-251. doi:10.1038/s41586-020-2140-0
【6】chen x, gole j, gore a, et al. non-invasive early detection of cancer four years before conventional diagnosis using a blood test.nat commun. 2020;11(1):3475. published 2020 jul 21. doi:10.1038/s41467-020-17316-z
【7】blauwkamp ta, thair s, rosen mj, et al. analytical and clinical validation of a microbial cell-free dna sequencing test for infectious disease.nat microbiol. 2019;4(4):663-674. doi:10.1038/s41564-018-0349-6
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原子吸收火焰法检测果汁中微量元素-PE PinAAcle 900光谱仪
PST 691U 南自变压器差动保护装置使用说明
阀门驱动装置的分类及应用
浅析地下管线探测仪在电缆检修工作中的作用
不锈钢真空手套箱为科学家提供了一个无氧、无湿、无尘的环境
体外诊断业的宠儿——游离DNA
螺旋压榨机工作原理及适用范围
在台位出售闲置二手乳品蝶式离心机
每天30方污水处理设备配置
工频无局放试验变压器的介绍
寻找有水平的影像测量仪厂家需要明白哪些？
塑料管帽的发展受到钢管行业影响如何
河南：以锂电池为重点，做大做强新能源电池核心产业
V7940数控转子线圈加工中心的改造
低温冷却循环泵的使用方法和注意事项
日本山武AZBIL阀门定位器工作原理
可燃气体探测器报警的处理办法
S型称重传感器技术参数
如何低温恒温浴槽安装湿球纱布
分析蛋白质测定仪价格的影响因素
图1 液体活检方案。人体血液中含有细胞、胞外膜囊泡(emvs)、游离dna (cfdna)、游离rna (cfrna)和蛋白质，可作为各种疾病的生物标志物
一、什么是游离dna?
游离dna又称循环dna、无细胞dna，是指存在于血浆、血清或尿液等体液中的细胞外dna。循环肿瘤dna是指坏死或凋亡的肿瘤细胞释放到外周血中的肿瘤dna片段，是肿瘤患者cfdna的一种。最早在1948年，mandel次在人类血液中检测到存在cfdna,但当时并没有引起科学界的关注。直到1977年,leon等报道了肿瘤患者外周血中存在较高水平的cfdna，随后众多学者开始了肿瘤患者外周血中cfdna研究。1997年,香港的卢煜明教授运用pcr技术在孕妇的血浆中扩增了y染色体特异性片段,证明怀有男胎的孕妇血浆中存在胎儿cfdna,从而为无创产前筛查奠定了基础。
关于cfdna的产生来源，目前普遍认为细胞主动释放、细胞发生凋亡、细胞坏死释放的dna片段是cfdna的主要来源。一般来说，癌症患者的正常循环cfdna水平比健康人高得多。因为随着肿瘤体积的增大，细胞的更新也随之增加，凋亡和坏死细胞的数量也随之增加。在正常的生理情况下，凋亡和坏死的残留物可通过浸润的吞噬细胞清除。但这不能有效地发生在肿瘤肿块内，导致细胞碎片的积累不可避免地释放到循环中使cfdna浓度显著升高。
图2 游离dna的主要来源
cfdna大部分为双链dna分子，其片段分布与核小体的结构有关，每个核小体单位包括一个组蛋白八聚体、dna分子及一分子h1；组蛋白八聚体构成核小体的盘状核心结构，146bp的dna分子超螺旋盘绕组蛋白八聚体1.75圈，组蛋白h1在核心颗粒外结合额外20bp dna，锁住核小体dna的进出端，起到稳定核小体的作用。因此cfdna长度主要集中在80-300bp,峰值位于166bp左右，且存在10.4bp的波动。cfdna在健康个体中通常浓度很低，血浆cfdna被认为主要来自造血系正常细胞的凋亡，其他组织的贡献很小。并且cfdna的半衰期很短，仅1-2小时，不稳定易降解。
相比于组织而言，检测cfdna具有三大优势1.可及性：cfdna容易获取，且可以反复取样；2.全面性：可全面反映肿瘤组织的异质性；3.实时性：可实时动态监测疾病的状态（如耐药方面），因此cfdna检测逐渐成为体外诊断应用方面的宠儿。
图3 cfdna的结构
图4 常规测序文库制备测定cfdna的片段长度
二、游离dna应用实例
图5 cfdna的应用
1.无创产前筛查（nipt）
基于1997年卢煜明教授及其团队发现孕妇的血浆内存有高浓度的胎儿dna，他们研发推出了唐氏综合征的无创检验方法—nipt（noninvasive prenatal testing），迅速被超过90个国家所采用。nipt即无创性胎儿染色体非整倍体检测，也称无创产前dna检测,在临床上主要用于唐氏综合征的筛查。通过采集孕妈妈外周血，从中提取游离dna（包含妈妈和宝宝dna），来分析宝宝的染色体情况。但以目前的医疗水平还不能治愈唐氏综合征，所以加强孕期产检，减少唐氏综合征患儿的出生十分重要。
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图7 ctdna可用于耐药突变及新发突变分析应用
2020年发表于nature杂志上的一篇文章，研究者对早期的肺癌患者治疗前血浆中ctdna的含量进行检测研究，发现在一定时间内（监测100个月）肺癌患者治疗前ctdna高的病人复发率以及远处转移率均高于ctdna含量低的病人，因此ctdna对于肿瘤的监测及预后方面具有一定积极意义。
图8 cfdna在肿瘤动态监测、预后方面的应用
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参考文献
【1】szilágyi m, pös o, márton é, et al. circulating cell-free nucleic acids: main characteristics and clinical application.int j mol sci. 2020;21(18):6827. published 2020 sep 17. doi:10.3390/ijms21186827
【2】lo ym, corbetta n, chamberlain pf, et al. presence of fetal dna in maternal plasma and serum.lancet. 1997;350(9076):485-487. doi:10.1016/s0140-6736(97)02174-0
【3】snyder mw, kircher m, hill aj, daza rm, shendure j. cell-free dna comprises an in vivo nucleosome footprint that informs its tissues-of-origin.cell. 2016;164(1-2):57-68. doi:10.1016/j.cell.2015.11.050
【4】wan jcm, massie c, garcia-corbacho j, et al. liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour dna.nat rev cancer. 2017;17(4):223-238. doi:10.1038/nrc.2017.7
【5】chabon jj, hamilton eg, kurtz dm, et al. integrating genomic features for non-invasive early lung cancer detection.nature. 2020;580(7802):245-251. doi:10.1038/s41586-020-2140-0
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【7】blauwkamp ta, thair s, rosen mj, et al. analytical and clinical validation of a microbial cell-free dna sequencing test for infectious disease.nat microbiol. 2019;4(4):663-674. doi:10.1038/s41564-018-0349-6
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