PCR反应开始前的准备工作及操作步骤
pcr反应开始前，你需要准备好dna模板（基因组dna或者反转录制备的cdna）,特异性的引物（手动设计或利用软件设计）并选择合适的商业化dna聚合酶（根据实验的目的不同做出决定）。pcr反应开始前的准备工作如下详解:
1. dna聚合酶的选择。市面上有多种dna聚合酶可供选择，他们的特性也各有不同。因此你需要选择自己实验需要的产品。通常我们将dna聚合酶分为高保真性聚合酶和普通的taq聚合酶。如果你希望得到没有任何突变的pcr产物，那应当选择高保真聚合酶。若你只是希望判断特异性序列的存在与否，那普通的taq聚合酶已经足够。另外要注意的一点是，进行t载体连接的时候，要了解高保真的聚合酶所得的产物是没有a末端的，因此你在t载体连接之前需要进行加a反应。或者直接选用普通的taq聚合酶。
2. 引物。引物特异性会影响到pcr反应成功的可能性，好的引物设计对pcr成功至关重要。设计引物时，有以下几条原则需要谨慎考虑：
1. 引物长度。通常pcr引物长度在18-22个碱基之间。这对引物的特异性以及退火温度而言均已足够。
2. 解链温度tm。tm值的定义是使得一半双链dna解螺旋成为单链dna的温度。引物的tm值通常要在52-58度之间。
3. gc含量。gc含量为40-60%。
就目前而言很多软件都可以用来设计引物，如primer5和oligo。通常这些软件设计得到的引物均可以满足需要。
操作步骤：
准备好各种试剂和pcr仪，就可以开始pcr实验：将各种试剂混合并按照说明书设置pcr反应。一般pcr循环如下：
1. 起始步骤：这对于热启动pcr而言是必须的，将反应混合液加热至94-98度以激活dna聚合酶。这一步的时间取决于所选用的dna聚合酶。
2. 变性步骤：dna本身是双链结构，而dna扩增需要引物与单链dna模板相结合。在这一步，反应混合液被加热至94-98度保持20-30秒以破坏双链间的氢键以便释放出单链dna。这是pcr循环中的第一步。
3. 退火步骤：变性之后，dna模板以单链的形式在反应混合液中存在。因为反应体系中的引物与dna模板互补，当反应温度降至50-65度时，引物与互补的序列形成氢键。退火温度主要取决于引物的tm值，通常比引物tm值低3-5度。这一步通常维持20-40秒，而聚合酶会结合至引物-模板双链处开始dna合成。
4. 延伸步骤：在这一步，dna聚合酶开始dna合成，因此这一步的温度选取的是dna聚合酶的优温度。通常我们选用72度，但某些dna聚合酶的最适温度是68度。这一步与体内的dna复制很相似：dna聚合酶按照碱基互补规律将dntps加到引物的3’末端最终得到新的dna双链片段。延伸时间取决于目的dna片段的长度和dna聚合酶的合成能力。一般而言dna聚合酶每60秒能够合成1kb长度的dna。
5. 第2步至第4步称为一个循环：每次循环之后dna的量均是前一次的两倍。通常一次pcr反应进行30-35个循环。在前几轮的pcr循环过程中pcr产物的量以指数速率增长，但是到了反应后期随着dntps和引物的量的减少以及dna聚合酶的失活，反应速率逐渐下降，因此pcr反应的产量也受到了限制。
6. 最后的延伸步骤：当30-35个循环结束后，我们通常会以68-74度延伸5-10分钟，这是希望使反应体系中残留的单链dna全部反应完毕。
7. 维持时间：通常我们设置4-10度为反应后pcr产物的保存温度。
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1. dna聚合酶的选择。市面上有多种dna聚合酶可供选择，他们的特性也各有不同。因此你需要选择自己实验需要的产品。通常我们将dna聚合酶分为高保真性聚合酶和普通的taq聚合酶。如果你希望得到没有任何突变的pcr产物，那应当选择高保真聚合酶。若你只是希望判断特异性序列的存在与否，那普通的taq聚合酶已经足够。另外要注意的一点是，进行t载体连接的时候，要了解高保真的聚合酶所得的产物是没有a末端的，因此你在t载体连接之前需要进行加a反应。或者直接选用普通的taq聚合酶。
2. 引物。引物特异性会影响到pcr反应成功的可能性，好的引物设计对pcr成功至关重要。设计引物时，有以下几条原则需要谨慎考虑：
1. 引物长度。通常pcr引物长度在18-22个碱基之间。这对引物的特异性以及退火温度而言均已足够。
2. 解链温度tm。tm值的定义是使得一半双链dna解螺旋成为单链dna的温度。引物的tm值通常要在52-58度之间。
3. gc含量。gc含量为40-60%。
就目前而言很多软件都可以用来设计引物，如primer5和oligo。通常这些软件设计得到的引物均可以满足需要。
操作步骤：
准备好各种试剂和pcr仪，就可以开始pcr实验：将各种试剂混合并按照说明书设置pcr反应。一般pcr循环如下：
1. 起始步骤：这对于热启动pcr而言是必须的，将反应混合液加热至94-98度以激活dna聚合酶。这一步的时间取决于所选用的dna聚合酶。
2. 变性步骤：dna本身是双链结构，而dna扩增需要引物与单链dna模板相结合。在这一步，反应混合液被加热至94-98度保持20-30秒以破坏双链间的氢键以便释放出单链dna。这是pcr循环中的第一步。
3. 退火步骤：变性之后，dna模板以单链的形式在反应混合液中存在。因为反应体系中的引物与dna模板互补，当反应温度降至50-65度时，引物与互补的序列形成氢键。退火温度主要取决于引物的tm值，通常比引物tm值低3-5度。这一步通常维持20-40秒，而聚合酶会结合至引物-模板双链处开始dna合成。
4. 延伸步骤：在这一步，dna聚合酶开始dna合成，因此这一步的温度选取的是dna聚合酶的优温度。通常我们选用72度，但某些dna聚合酶的最适温度是68度。这一步与体内的dna复制很相似：dna聚合酶按照碱基互补规律将dntps加到引物的3’末端最终得到新的dna双链片段。延伸时间取决于目的dna片段的长度和dna聚合酶的合成能力。一般而言dna聚合酶每60秒能够合成1kb长度的dna。
5. 第2步至第4步称为一个循环：每次循环之后dna的量均是前一次的两倍。通常一次pcr反应进行30-35个循环。在前几轮的pcr循环过程中pcr产物的量以指数速率增长，但是到了反应后期随着dntps和引物的量的减少以及dna聚合酶的失活，反应速率逐渐下降，因此pcr反应的产量也受到了限制。
6. 最后的延伸步骤：当30-35个循环结束后，我们通常会以68-74度延伸5-10分钟，这是希望使反应体系中残留的单链dna全部反应完毕。
7. 维持时间：通常我们设置4-10度为反应后pcr产物的保存温度。
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