热带念珠菌探针法荧光定量PCR试剂盒使用方法
热带念珠菌探针法荧光定量pcr试剂盒使用方法：
一、稀释pcr阳性对照（以10e2-10e7拷贝/μl这6个10倍稀释度为例）
1. 注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的dna片段作为阳性对照。
2. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。
3. 用带芯枪头分别加入45 μl荧光pcr专用模板稀释液（用带芯枪头，下同）。
4. 在7号管中加入5 μl 1×10e8拷贝/μl 的阳性对照，充分震荡1分钟，得1×10e7拷贝/μl的阳性对照。放冰上待用。
5. 换枪头，在6号管中加入5 μl 1×10e7拷贝/μl 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10e6拷贝/μl的阳性对照。放冰上待用。
6. 换枪头，在5号管中加入5 μl 1×10e6拷贝/μl的阳性对照到5号管中，充分震荡1分钟，得1×10e5拷贝/μl的阳性对照。放冰上待用。
7. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品dna的制备
8. 如果有n个样品，必须设置n+2个提取，多出的一个是pc（样品制备阳性对照），一个是nc（样品制备阴性对照）。可以用10μl上步制备的pcr阳性对照的第4号（浓度为1×10e4 拷贝/μl，10μl相当于1万拷贝）或第5号（浓度为1×10e5 拷贝/μl，10μl相当于10万拷贝）再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为pc。另外用水作为nc。如果每次制备需要200μl样品，则pc和nc的体积也必须是200μl。
9. 用自选方法纯化样品的dna，本试剂盒跟市场上大多数病毒dna提取试剂盒兼容。
三、设置qpcr反应（20 μl体系，在样品制备室进行）
10. 如果只做1次重复，则标记n+9个pcr管，其中n+2个用于上步得到的n+2个样品，1个用于pcr阴性对照，6个用于pcr阳性对照。如果做2-3次重复，则反应设置数量相应增加2或3倍。
11. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后加）
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2. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。
3. 用带芯枪头分别加入45 μl荧光pcr专用模板稀释液（用带芯枪头，下同）。
4. 在7号管中加入5 μl 1×10e8拷贝/μl 的阳性对照，充分震荡1分钟，得1×10e7拷贝/μl的阳性对照。放冰上待用。
5. 换枪头，在6号管中加入5 μl 1×10e7拷贝/μl 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10e6拷贝/μl的阳性对照。放冰上待用。
6. 换枪头，在5号管中加入5 μl 1×10e6拷贝/μl的阳性对照到5号管中，充分震荡1分钟，得1×10e5拷贝/μl的阳性对照。放冰上待用。
7. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品dna的制备
8. 如果有n个样品，必须设置n+2个提取，多出的一个是pc（样品制备阳性对照），一个是nc（样品制备阴性对照）。可以用10μl上步制备的pcr阳性对照的第4号（浓度为1×10e4 拷贝/μl，10μl相当于1万拷贝）或第5号（浓度为1×10e5 拷贝/μl，10μl相当于10万拷贝）再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为pc。另外用水作为nc。如果每次制备需要200μl样品，则pc和nc的体积也必须是200μl。
9. 用自选方法纯化样品的dna，本试剂盒跟市场上大多数病毒dna提取试剂盒兼容。
三、设置qpcr反应（20 μl体系，在样品制备室进行）
10. 如果只做1次重复，则标记n+9个pcr管，其中n+2个用于上步得到的n+2个样品，1个用于pcr阴性对照，6个用于pcr阳性对照。如果做2-3次重复，则反应设置数量相应增加2或3倍。
11. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后加）
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